分子生物学-10-2-C库教学教材.pptVIP

4 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 cDNA末端的处理 由于大片段的平末端连接效率非常低，因此为了避免用平末端与载体连接，对双链cDNA的末端进行加工是十分必要的 方法：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的粘性末端 末端转移酶—可以向cDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部 不讲 5.3.4 cDNA文库的构建 双链cDNA的克隆： 双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中： 1 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 2 平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段 3 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 不讲 基因组DNA文库 cDNA文库 二、基因组DNA文库与cDNA文库的比较 1 基因组DNA文库的优点总结 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 2 cDNA文库的主要优点 ①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 ②cDNA文库的筛选比较简单易行。 ③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 ④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 ⑤cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能研究。 3 cDNA克隆的主要的缺点 cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。 cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。 在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。 5.3.5 基因文库的筛选与鉴定page189 任军慧(117654390) 单位：广州生物工程中心 菌落原位杂交法 PCR筛选法 表型筛选法 显色反应选择法 免疫筛选法 1 菌落原位杂交法 （colony in situ hybridization） ●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。 又叫“核酸杂交法” PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。 挑白 稀释 PCR 电泳 (1)抗药性筛选（插入失活筛选法）:这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。 通过在抗药性标记上插入外源片段引起该标记所在基因的失活，然后在相应选择性培养基上进行抗药性培养。 3 表型筛选法 为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。 (2)显色反应选择法(α-互补法) 将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。 α 互补的检测或?-半乳糖苷酶法 Page 176 多克隆位点 β半乳糖苷酶 N段编码序列 启动子 裂开的N端 外源DNA 裂开的N端 转化 细菌在含有X-gal和Lac操纵子 诱导剂的培养基上培养 β半乳糖苷酶 C段编码序列 含有重组体pUC18的 白色菌落 含有载体 pUC18的 白色菌落 染色体 染色体 pUC18 pUC18 pUC18 pUC18 E,coli E,coli 转化 α-互补： 现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146