分子生物学-11-1-转录组测序yu基因敲除宣讲培训.pptVIP

置换法和插入法 置换法 G418是一种选择性培养基 正常老鼠 HSV-tk HSV-tk Target gene Exon 1 2 3 neor vector Exon 4 同源区 同源区 新霉素抗性基因 正向选择标记 负选择标记 疱疹病毒胸苷激酶基因 杀死非重组型细胞 neor HSV-tk 重组型 非重组型 基因敲除技术 完全基因敲除 条件型基因敲除 1、完全基因敲除 通过同源重组法完全消除ES细胞的靶基因活性从而导致后代动物个体中该基因完全失活。 2、条件型基因敲除 在某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。具有发育的组织特异性。 1、完全基因敲除基本原理: 构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志 疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)作为负选择 体外培养 新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选 将重组体导入ES细胞 存活的ES细胞 了解 兄妹互交，增加隐性基因 的产生比例 了解 与完全敲除的主要区别： 1、ES受体细胞时间不同 2、发育后只在部分组织中敲除，具有组织特异性 2、条件型基因敲除 在某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。具有发育的组织特异性。 常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统 转基因动物的制作方法 一、受精卵雄原核显微注射法 二、胚胎干细胞（ES细胞）法 三、逆转录病毒感染法 四、体细胞核移植法 五、精子载体法 六、YAC法 电穿孔法 显微注射法 脂质载体包埋法 裸露DNA直接注射 磷酸钙—DNA共沉淀法 病毒介导的生物学方法 一般的转基因方法 转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。 1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”－将大鼠生长激素导入小鼠 1.显微注射法制备转基因动物 分子生物学（技术）讲义 山西师范大学生命科学学院 gg 第六章 基因功能研究技术 第六章 分子生物学研究法（下） sequncing 6.1 转录组测序 什么是转录组？ 某生物某特定生理条件下某个细胞或者组织中全部RNA；特指全部mRNA. 应用：干什么的？ 研究全部基因表达情况 转录组研究的方法 传统方法（基于Sanger 测序技术的）： 表达序列标签 expressed sequence tag,EST 基因表达序列分析 Serial Analysis of Gene Expression, SAGE 新方法（基于新测序技术的） 454, solexa, SOLiD 451 6.1.2 RT-PCR法研究RNA的选择性剪接 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。 平衡剪切 5’选择性剪切 3’选择性剪切 外显子遗漏型剪切 相互排斥性剪切。 RT-PCR法可以研究某个基因是否存在选择性剪切。 RT-PCR检测5个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切 检测基因表达的常用RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交:用放射性或非放射性（如地高 辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基 因的表达产物做出定性定量分析。 mRNA的互补链， 杂交信号集中于 纤维细胞中。 负对照，mRNA的 同义链, 无杂交 信号 正对照，UBQ10杂交信号遍布于 整个胚珠 Mutation of?Arabidopsis BARD1?Causes Meristem Defects(茎尖缺陷)? 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH) FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。 报告分子如生物素、地高辛，与荧光素标记反应，来确定该DNA序列在染色体上的位置。 荧光原位杂交（FISH） 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置。 荧光标记探针检测精子 6.1.4 基因定点突变技术 概念：通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列 作用：用于研究基因产物功能： 氨基酸残基对蛋白