分子生物学-14-真核调控-2-反式因子宣讲培训.pptVIP

锌指结构 Functional domains of zinc finger transcription factors. Cysteine (C) and histidine (H) coodinate a zinc atom, causing the looping out of the zinc fingers 转录激活 结构域 DNA结合 蛋白质主链 锌指其实是这个转录因子的一个结构域，尤其是指DNA结合结构域，而转录激活结构域则位于主链上 锌指核酸酶介导的基因打靶（ZFN技术） 人工突变的锌指蛋白的每个锌指可以识别特定的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三联体。多个锌指串联起来就可以识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性。 把锌指蛋白与来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶FokI融合在一起就形成了锌指核酸酶ZFN，可以用来进行基因修饰，比如基因打靶、基因敲除等，从而用于临床的基因治疗。 祝福你 Zinc-finger nuclease 每个锌指识别一个三联体 注意：page312图8-18，有误：不明不白 交错切割位点 锌指核酸酶介导的基因打靶（ZFN技术） 祝福你 锌指核酸酶介导的基因打靶（ZFN技术） 祝福你 实现单个氨基酸突变 ZFN技术祝福你技术背后的故事 技术垄断 临床利益 反垄断 ZFN技术的改进TALEN技术 顺式元件与反式因子作用的分子本质是特异的氨基酸（序列）与特定的碱基（序列）相互识别并且结合 注意page315图8-23，不明不白，方块中漏印了太多的东西 转录激活子类似蛋白效应因子（Transcription Activator-Like Protein Effector, TALE）是黄单胞菌属病原菌分泌到宿主植物细胞中的一种毒性蛋白，可以识别植物DNA，驱动基因表达。 TALE 蛋白中部的一段串联重复序列具有与目标DNA 序列特异识别及结合的能力， 串联重复序列由33-35 个氨基酸残基构成， 不同的TALE 蛋白的串联重复序列不同，是因为其中第12、13 位的氨基酸残基在不同重复单元中为可变氨基酸残基，被称为RVD（repeat-variable di-residue）。 不同RVD 组合特异性地对应一个核苷酸 最为常见的编码方式为： NG （ Asn Gly） →T、 HD（His Asp ）→C、NI（Asn Ile ）→A、NN （ Asn Asn ） →G。 TALEN 技术 TALEN 技术 这种氨基酸与核苷酸的一一对应关系，提供了一种思路，成功解决了ZFN 方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响的问题，使目标基因定向修饰变得简单可行。 2010 年，由美国Daniel Voytas 首先将其应用于靶向核酸酶构建中，将TALE 的DNA 结合相关结构域与FokI 的核 酸酶结构域融合，获得了针对特定DNA 序列具有特异切割活性的靶向核酸酶――TALEN（transcription activator-like effectors nuclease）。 应用TALEN 技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在目标生物基因组靶向性引入DNA 双链断裂，进而依靠细胞内源DNA 修复机制，实现目标位点的定向修饰，如Knock-out、Knock-in 及Replacement等。 NN NLS AD 构建TALEN 体内修复 3、Leucine zippers 1、 DNA结合结构域基序 亮氨酸拉链：是亲脂性α螺旋，包含有许多集中在螺旋一边的疏水氨基酸，两条多肽链以此形成二聚体。每隔6个残基出现一个亮氨酸。由赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）组成DNA结合区。 一种特殊的α螺旋，疏水氨基酸集中排列在螺旋的一侧，疏水表面是两个蛋白质分子构成二聚体的接触点 α螺旋的特点是Leu频繁出现，每7个aa残基中出现一个，延α螺旋的疏水侧排列成直线 与Leu重复区相邻的是碱性氨基酸含量较高的DNA结合区。形成二聚体时该碱性区对DNA的亲和力较高 亮氨酸之间相互作用形成 二聚体的“拉链” 。 肽链氨基端20～30个富含碱性 氨基酸结构域与DNA结合。 这类蛋白质的DNA结合结构域 是以碱性区和亮氨酸拉链结构 域整体作为基础的。 当来自同一个或不同多肽链的两个α-螺旋的疏水面（常常含有亮氨酸残基）相互作用形成一个圈对圈的二聚体结构时就形成了亮氨酸拉链。 碱性结构域 二聚体结构域 图8-20 leu leu 疏水区leu相互作用 碱性区 与DNA结合 亮氨酸拉链的肽链上每相隔七个残基就会有一个疏水的亮氨酸残基，这些残基位于DNA结合域的C端-α螺旋上，这样α-螺旋的侧面每两圈就会出现一个亮氨酸，形成一个疏水的表面。结果在α-螺旋的疏水表面间就可以互相作用