分子生物学-09-5-PCR-RT-PCR-Real-time讲解材料.pptVIP

为了获取未知起始量的待测样品的含量的试验的准确性，增加 1、阴性对照 内参基因 （持家基因） 2、已知模板量的标准品page180，5-13a中的7条曲线 3、每个样品平行试验3个重复 一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 TaqMan荧光定量PCR的原理 操作原理：是在待扩增区域（特定的模板DNA）结合上荧光DNA探针，PCR过程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物链到DNA探针时，将DNA探针逐个降解，释放出荧光报告基团，可以发出荧光，而且PCR体系中发出荧光的强度与PCR产物量之间存在线性关系，而PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此可通过测定荧光强度来对起始模板量进行定量分析 SYBER GREEN的缺点导致TaqMan荧光探针的诞生 由于Taqman探针3′端Q荧光分子能够吸收5′端R荧光分子发出的荧光,因此,正常情况下该探针检测不到5′端荧光分子发出的荧光，只能检测到到3‘端荧光分子的荧光信号。但当溶液中有模板时,探针与模板退火,互补结合，即产生了适合于核酸外切酶活性的双链底物,从而激活Taq 酶的5′外切酶活性,将探针5′端连接的R荧光分子从探针上切割下来,破坏了两个荧光分子间的FRET ,从而使得R发出的荧光在识别其波长的范围内能够被检测到,切割的R荧光分子数与PCR 产物的数量成比例,因此,根据PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量 SYBER GREEN荧光染料能够与全部DNA双链结合，特异性较差， 为了专门针对特定模板的检测，我们可以根据模板上一小段DNA序列为依据，设计出其互补序列做探针，在这个探针两端分别加上发光基团R（reporter）和淬灭基团Q（quencher）。 R和Q都可以自主发光，但是两个光的波长不同，有一定的重叠，二者因为靠的很近，相互之间的发光就通过荧光共振能量转移FRET相互淬灭掉了。 Taqman实时PCR技术原理 荧光探针特异结合 DNA聚合酶的外切活性逐步降解探针 发光基团得以释放，开始发光 Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: LC Red 640 Excitation Emission Transfer 荧光共振能量传递（FRET Probe） R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） R Q Excitation R Q Q R Excitation Emission 新的标记形式：分子信标 （Molecular Beacon Probe） 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ R Q 5’ R Q R Q 3’ 5’ Q R R R Emission Excitation Q R 引物特异性探针（Amplifluor Probe） 分子生物学讲义第五章 方法 郜刚 QQ:763353734 山西师范大学生命科学学院 5.2.3 Polymerase Chain Reaction, PCR 聚合酶链式反应(PCR)，是一种在体外(in vitro)短时间内大量、迅速的选择扩增特定的靶DNA序列的核酸扩增方法。 1983, Mullis page165 1985年 Kary Mullis及同事创立。随后借助于热稳定性Taq DNA聚合酶的发现 1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。 1993年度，Kary Mullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得诺贝尔化学奖。 Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为