crmp4与微丝相互作用介导海马神经元突起生长和树突棘形成的分析word格式论文.docxVIP

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2018-05-18 发布于上海
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crmp4与微丝相互作用介导海马神经元突起生长和树突棘形成的分析word格式论文.docx

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crmp4与微丝相互作用介导海马神经元突起生长和树突棘形成的分析word格式论文

目的：中文摘要探讨CRMP4是否能与微丝发生相互作用并明确结合部位，以及如何影响神经元的轴突、树突及树突棘发育。方法：首先构建GST-CRMP4及其截短片段原核质粒，然后进行体外表达其融合蛋白，利用pull-down实验分析CRMP4与微丝的结合部位；最后构建CRMP4及其截短片段的真核质粒，转染至原代培养的海马神经元，观察CRMP4与微丝结合后对神经元突起生长及树突棘形成的作用。结果：（1）构建重组原核质粒酶切结果显示，酶切条带大小与预期的相符，CRMP4的截短片段GST-CRMP4ΔN323、GST-CRMP4ΔC471测序结果与预期的序列完全吻合，无突变发生；（2）原核表达系统表达相应的CRMP4及其截短片段质粒的融合蛋白，融合蛋白分子量分别为90.7kDa、53kDa、77kDa，与预期大小一致；（3）用体外表达的CRMP4及其截短片段质粒的与脑组织蛋白提取液进行的pulldown实验，结果显示，GST-CRMP4、GST-CRMP4ΔN323可以成功层析出肌动蛋白；（4）构建重组真核质粒酶切结果显示，酶切条带大小与预期的相符，CRMP4的截短片段CRMP4ΔN323、CRMP4ΔC471测序结果与预期的序列完全吻合，无突变发生（5）将构建成功的CRMP4及其截短质粒和对应的空载体使用钙磷转染法转染至原代培养的海马神经元，然后通过免疫细胞化学来观察发现CRMP4与微丝结合后可以促进神经元突起生长及树突棘形成。结论：（1）成功构建了CRMP4截短片段的原核和真核表达载体；（2）体外成功表达了GST-CRMP4及其截短片段的融合蛋白；（3）GST-CRMP4、GST-CRMP4△N323与微丝蛋白结合，但GST-CRMP4△C471不与微丝蛋白结合，说明CRMP4与微丝的结合位点位于C末端的471-570I氨基酸中；（4）真核质粒CRMP4和CRMP4△N323通过微丝相互作用促进神经元突起生长及树突棘形成。关键词：坍塌反应调节蛋白；微丝；神经元；生长锥；树突棘；原核表达；IIObjective:ABSTRACTTheaimoftheexperimentistoexplorewhethercanCRMP4interactwithactinandto investigatewherecanCRMP4interactwithactin,andhowtoinfluencethegrowthofneuritesandformationofthedendriticspineinhippocampalneuronsbytheirinteraction.Methods:Firstly,theprokaryoticplasmidofCRMP4ΔN323,CRMP4ΔC471wereconstructedand thefusionproteinsofthemwereexpressed.TheGSTpull-downassaysweretodetectwhichpartoftheCRMP4canbindwithactininvitro;Secondly,theeukaryoticplasmidsof CRMP4 transfecttotheneuronandobservethegrowthofneuritesandformationofthedendriticspinein hippocampalneurons.Results:Theresultsofrecombinantplasmiddigestedbyrestrictionenzymeshowthatthesizesof targetgeneswere consistentwiththeanticipation,andtheDNAsequencingshowedno mismatchandmutationexistinginGST-CRMP4,GST-CRMP4ΔN323,GST-CRMP4ΔC471.ThefusionproteinsofGST-CRMP4,GST-CRMP4ΔN323,GST-CRMP4ΔC471wereexpressedsuccessfully.Andtheirmolectularweightwereabout90.7kDa,53kDa,77 kDa,whichconsistentwiththeexpectedsizeofthesumoftargetproteinandGSTprotein size.GSTpull-downexperimentresultsshowsthefusionproteinsofGST-CRMP4,GST- CRMP4ΔN323canbindwithactininratbrainlysateinvitro,butGST-CRMP4ΔC471