bmp2慢病毒载体的构建及转染后骨髓间充质干细胞骨软骨分化的研究word格式论文.docxVIP

目录中文摘要……………………………………………………………………………3Abstract……………………………………………………………………………5 前言……………………………………………………………………………7 第一部分BMP-2 GFP融合表达慢病毒载体的构建与鉴定………………………10 材料与方法………………………………………………………………10结果…………………………………………………………………26 讨论…………………………………………………………………33 第二部分BMP-2、TGF-β1基因修饰BMSCs及成骨、软骨分化的研究………37 材料与方法…………………………………………………………………37结果…………………………………………………………………45 讨论………………………………………………………………51 参考文献…………………………………………………………………55 致谢…………………………………………………………………60 综述……………………………………………………………………612BMP-2慢病毒载体的构建及转染后骨髓间充质干细胞骨软骨分化的研究中文摘要【目的】1.构建骨形态发生蛋白-2（BMP-2）重组慢病毒表达载体；2.TGF-β1、BMP-2重组慢病毒转染BMSCs后向成骨、软骨细胞的分化,为探索体外组织工程化骨软骨的构建提供新的思路。【方法】1.构建携带BMP-2基因的重组慢病毒表达载体：将提取的BMP-2 cDNA包装至慢病毒表达载体，在脂质体Lipofectamine2000作用下转染293T细胞，通过酶切电泳分析和及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定，RT-PCR测定病毒滴度；Western blot法检测所构建质粒能在293T细胞中表达活性。2.以BMP-2重组慢病毒载体转染BMSCs，通过荧光表达法判定感染复数（Multiplicitiesofinfection,MOI），免疫组化、Real-timePCR、Westernblot 和酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)判定感染后的BMSCs中BMP-2的表达情况；MTT法检测其转染后的增殖活性；ALP活性检测、碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察矿化结节形成能力对其成骨分化能力进行分析；以TGF-β1重组慢病毒载体转染BMSCs，经一段时间的培养后，II型胶原免疫组织化学染色及RT-PCR法检测经TGF-β1转染后BMSCs的成软骨分化能力。【结果】1.成功构建BMP-2重组慢病毒表达载体，经酶切及测序结果完全正确，转染293T 细胞后获得滴度为4.07×108/ml慢病毒浓缩液。2.BMP-2重组慢病毒可高效转染BMSCs，最佳MOI值100，转染后BMSCs可高效稳定表达BMP-2RAN及蛋白；MTT法检测显示转染后BMSCs的生长增殖明显增强；碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测及钙结节染色发现转染两周后碱性磷酸酶和钙结节表达阳性；免疫组织化学染色及RT-PCR法发现TGF-β1转染后的BMSCs 可表达II型胶原蛋白及II型胶原RNA。【结论】3成功构建BMP-2重组慢病毒表达载体，转染BMSCs后可持续高效表达BMP-2RAN及蛋白；BMSCs经BMP-2、TGF-β1慢病毒转染后，经一定时间的培养后可诱导其向成骨、软骨细胞分化。【关键词】骨髓间充质干细胞；慢病毒；基因转染；骨形态发生蛋白-2；成骨分化；组织工程。4ToConstructRecombinantLentivirus VectorsofBMP-2GeneandStudyaboutBMSCsOsteochondralDifferentiation afterTransfectedAbstract[Objective]:Toconstructrecombinant lentivirus vectorsofBMP-2gene.LV-BMP-2andLV-TGF-β1genetransfectandinduceBMSCsdifferentiationinto osteoblastsandchondroblasts,provide newthought to explorethebonetissueengine- eringintheconstructionofthecartilage.[Methods]:ConstructrecombinantlentivirusvectorsofBMP-2 gene:TheBMP-2cDNA were extractedandpackedintolentivirusvectorandtransfectedthe293Tcellsthrough liposomeLipo