bmp2和ho1共同表达载体的构建及转染对大鼠脂肪干细胞增殖 凋亡及成骨分化的影响word格式论文.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于必威体育官网网址，在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要目的：从SD大鼠体内提取脂肪组织并分离培养大鼠脂肪基质干细胞（Adipose-derivedstromalcells,ADSCs），并通过条件诱导基培养及流式细胞仪检测鉴定其生物学特性；在体外构建构建血红素氧化酶1（Hemeoxygenase1, HO-1）和骨形态发生蛋白2（BoneMorphogeneticProtein2，BMP-2）共同高表达慢病毒载体，并转染大鼠脂肪基质干细胞，观察其增值、凋亡和成骨的影响。方法：1.从SD大鼠体内提取脂肪组织，使用胶原酶消化，对其进行离心后，获得大鼠ADSCs，接种于培养皿中培养并传代。在倒置显微镜下观察其形态特点，并通过流式细胞仪对其表面标记物进行鉴定，确定为ADSCs后使用条件诱导基进行培养，鉴定其成骨及成脂能力。2.将购置的含有HO-1和BMP-2 目的基因的pUC57载体及实验室提供的慢病毒表达载体pZsG进行相同位点的酶切并重组，通过转化大肠杆菌DH5α进行扩增，挑取阳性克隆后进行菌落PCR鉴定，结果为阳性后提取质粒，并在293T细胞中包病毒，收取毒液后转染大鼠ADSCs。通过westernblot实验鉴定转染后的大鼠ADSCs内是否有HO-1和BMP-2目的基因的表达。3.联合前期实验结果将细胞分为四组：ADSCs转导HO-1组、ADSCs转导BMP-2组、ADSCs转导双基因组和ADSCs未转导组。采用MTT实验和克隆形成实验比较各组的增值能力；通过流式细胞仪分析比较各组凋亡率；通过成骨培养基培养后镜下观察并常用ImageJ定量分析比较各组成骨分化能力。结果：1.成功体外分离及培养大鼠ADSCs，在倒置显微镜下可见其为梭形或多角形细胞，并呈集落样生长，通过条件诱导基的培养，大鼠ADSCs具有成骨和成脂分化能力，流式细胞仪鉴定结果CD29、CD44、CD90为阳性表达，具有干细胞特性，而CD45和CD31为阴性表达，排除造血干细胞混杂。成功构建含有HO-1 和BMP-2的pZsG-HO-1-IRES-BMP-2高表达载体，成功转染大鼠ADSCs，通过westernblot实验鉴定转染后的大鼠ADSCs内有HO-1和BMP-2目的基因的表达。3.转染后的大鼠ADSCs通过MTT实验和克隆形成实验鉴定发现在增值率方面双基因组增值率低于HO-1组（p0.05）；通过流式细胞分析在凋亡率方I面双基因组增值率高于HO-1组（p0.05）；在成骨分化方面双基因组增值率低于BMP-2组（p0.05）。结论：1.通过体外分离，胶原酶消化，密度梯度离心联合贴壁方法可成功培养生长稳定、增值能力强的大鼠ADSCs，通过条件诱导基的培养及流式细胞鉴定证明其具有成脂及成骨能力，并具有干细胞特性。2.成功构建含有HO-1和BMP-2 的pZsG-HO-1-IRES-BMP-2高表达载体，成功转染大鼠ADSCs。3.BMP-2与HO-1联合基因修饰的ADSCs细胞增殖能力较单HO-1基因修饰的ADSCs增殖能力弱。4.BMP-2与HO-1联合基因修饰的ADSCs细胞凋亡率较单HO-1基因修饰的ADSCs凋亡率高。5.BMP-2与HO-1联合基因修饰的ADSCs可向成骨细胞分化，但较单BMP-2基因修饰的ADSCs成骨分化能力弱。关键词：脂肪干细胞BMP-2 HO-1转染基因表达IIAbstractObjective:First,toisolateandidentifiedtheADSCsfromthetheadiposetissueof SDrats.Theco-expressionoflentiviralvectorsmediatedHO-1andBMP-2expressedwithhigh level inADSCswereconstructed.Toinvestigate theviability、apoptosis、osteogenicdifferentiationaftertheco-exp