bmp2胶原掺锶羟基磷灰石成骨活性材料的研究word格式论文.docx

BMP-2/胶原/掺锶羟基磷灰石成骨活性材料的研究华中科技大学附属协和医院骨科博士研究生：杨大志导师：郑启新教授摘要第一部分骨形态蛋白-2对人脐带间充质细胞增殖和分化的影响目的探讨骨形态发生蛋白-2（bonemorphogeneticprotein-2,bmp-2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell ，hUCMSC）的增殖和分化的影响。方法体外培养人脐带间充质干细胞，用流式细胞仪鉴定细胞表面CD34、CD45、 CD105、CD45、CD73和HLA-DR分子的表达。实验分为6组，分别是10%血清DMEM、 10%血清DMEM+成骨诱导培养基、10%血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)、2%血清DMEM、2% 血清DMEM+成骨诱导培养基、2%血清DMEM+BMP-2(20ug/ml)，噻唑蓝(MTT)比色法观察不同培养基培养对人脐带间充质干细胞的增殖影响，流式细胞术检测BMP-2作用后细胞表面STRO-1表达的变化，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量BMP-2作用后人脐带间充质干细胞的骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）、碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）、I型胶原蛋白(type 1 collagen,COL1)的mRNA表达变化，碱性磷酸酶染色观察人脐带间充质干细胞在BMP-2培养基作用下细胞碱性磷酸酶表达阳性细胞的比例变化，Von kossa染色试验观察BMP-2对人脐带间充质干细胞钙结节形成的情况结果人脐带间充质干细胞经流式细胞术鉴定为CD34(-)、CD45(-)、CD44(+)、 CD73(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)细胞。对比无BMP-2和加BMP-2的培养基中培养细胞1，3，5，7天，虽然细胞的增殖率在上升，但是在组间比较，无明显意义（P0.05），同时在2%血清的培养基中培养7天后，hUCMSC的增殖促进才10%左右。BMP-2培养7天后细胞表面STRO-1阳性细胞比例上升明显，由25.1±4.0上升至51.1±6.4（P0.01）。BMP-2培养条件下，COL1mRNA的表达可以见到增强（P0.05），OPNmRNA 出现表达， ALPmRNA比无BMP-2培养出现明显增强（P0.05）。在BMP-2培养条件下，碱性磷酸酶染色出现大片阳性染色。在培养28天，Vonkossa染色出现明显的钙结节。结论骨形态发生蛋白-2对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化作用明显，而增殖作用很弱。关键词骨形态发生蛋白-2，人脐带间充质干细胞，成骨分化第二部分锶对人脐带间充质细胞成骨分化影响的研究目的探讨氯化锶诱导人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymalstem cell ，hUCMSC）成骨分化过程中β-连接蛋白（β-Catenin）的作用。方法体外培养人脐带间充质干细胞，实验分为3组，空白组：10%胎牛血清+DMEM 培养基，对照组：10%胎牛血清+DMEM培养基+成骨培养基，实验组：10%胎牛血清+DMEM 培养基+氯化锶，检测3组不同培养基培养后人脐带间充质细胞的碱性磷酸酶活性变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测量人脐带间充质干细胞的骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）、β-Catenin、I型胶原蛋白(type1collagen,COL1)的mRNA 表达变化，蛋白印迹法检测β-Catenin蛋白表达的变化。荧光染色观察在加入氯化锶的培养基中β-Catenin的表达。Vonkossa染色试验观察人脐带间充质干细胞钙结节形成的情况。结果实验组细胞在第5天，碱性磷酸酶活性由39.871±8.166 U/t增加到 70.317±14.231U/t，在第14天，实验组的碱性磷酸酶的活性可以高达138.617±40.207U/t，与空白组和对照组相比都有明显增加（P0.05）。在实验组人脐带间充质干细胞的碱性磷酸酶（ALP）mRNA出现高表达（P0.05）。空白组的骨桥蛋白（OPN）表达很弱，而对照组和实验组的OPN出现明显的表达（P0.05）。对比空白组和对照组，实验组I型胶原蛋白（COL1）的表达可以见到明显增强（P0.05）。空白组的β-Catenin蛋白表达很弱，而对照组和实验组的β-Catenin蛋白出现明显的表达（P0.05）。细胞荧光观察到在还有氯化锶培养基中培养的细胞中出现细胞浆内红色荧光，部分细胞核也有红色荧光。含有氯化锶的培养基中培养28天后，可以看到hUCMSC形成大量的钙结节。结论 β-Catenin是氯化锶诱导人脐带间充质干细胞细胞成骨诱导分化中重要通路蛋白。关键词人脐带间充质干细胞,成骨分化,氯化锶第三部分骨形态蛋白-2