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克隆及治疗性克隆 Clone一词来源于希腊文，原意是“扦插的枝条，及无性繁殖。 1902年，德国植物学家Aberrant提出，植物的体细胞具有母体的全部遗传信息，并且能发育成为完整个体的能力。 1903年，Webber将这一概念引入园艺学。 至此，克隆这一概念逐渐被用于细胞生物学、动物学、医学等。 第一节 克隆的概念 一、克隆和治疗性克隆的一般概念 克隆(clone) 指通过无性方式由单个细胞或个体产生的、和亲代非常相似的一群细胞或生物体，在不发生突变的情况下，一个克隆内的所有员具有完全相同的遗传构成。 克隆的概念强调两点： 1、以无性的方式进行增殖或繁殖； 2、一个克隆中的每一成员其遗传构成完全相同。 体细胞克隆：供体细胞核是体细胞的称为体细胞克隆。 体细胞克隆分为： 生殖性克隆或繁殖性克隆（reproductice cloning） 治疗性克隆（therapeutic cloning）  生殖性克隆是一种“复制”动物个体的生物技术，是成体细胞核移植到去核卵母细胞中，或融合形成重组胚，使已分化的细胞核重新编程，再移植到代母或者供卵者子宫内发育成为新个体。 治疗性克隆则是将患者的体细胞核移入去核的卵细胞形成重构胚，经过一定处理，待发育至囊胚（14天以前），分离内细胞团，纯化，培养、筛选、建立胚胎干细胞系，定向诱导分化成为“预定”的细胞、组织器官；移植入病人病变部位，或作为组织工程用的种子细胞，以取代患者已丧失功能的细胞，修复或取代组织、器官，达到治疗的目的。 克隆分为四个层次： 分子克隆。 细胞克隆 组织器官克隆 个体克隆 （一）克隆技术的萌芽 先成论（Theory of Priformationism） 第二节 克隆及治疗性克隆技术路线 克隆动物 世界上第一只克隆哺乳动物 ：1981年，Hoppe等发表文章，声称从早期胚胎细胞克隆出3只小鼠，当时对其结论学术界有争论。 1986年，Prather将早期牛胚胎细胞核移入到牛卵中，在绵羊输卵管中发育成囊胚，再植入代孕母牛子宫，克隆小牛犊出生。 以上实验所用供体细胞是早期胚胎，而不是分化细胞，或成体细胞。 克隆羊——Dolly 克隆步骤： a. 取苏格兰黑脸母羊的未受精卵，去细 胞核用作受体。 b. 取芬兰白脸母羊乳腺细胞,在培养基中 培养用作供体。 c. 将供体细胞核移植到受体去核卵细胞,放在 培养器中，用电击法使其膜融合. d. 继续培养6天后形成桑椹胚. e. 将桑椹胚移入苏格兰黑脸母羊子宫. f. 苏格兰黑脸母羊怀孕148天后产生白脸多莉 . 在多莉羊诞生后，克隆技术取得了很大的发展，美国夏威夷大学的科学家们于1998年7月利用体细胞克隆技术克隆出卡姆莉娜鼠、50只，2000年7月，相继克隆出猪、猴、牛。 构建克隆胚原则和程序 1、供体（donor）细胞的条件： 1）?取材 选择取材方便，受外界条件（如紫外线，化学物质等）刺激相对较小，细胞活力相对较高的细胞作核供体；睾丸支持细胞、神经细胞、卵丘细胞、尾尖成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、成熟B细胞和T细胞等均可作供体细胞。 2）?年龄 年龄越小越好。目前世界多个国家建立了“细胞银行”，收集、存放脐血干细胞及个人早期干细胞，如果患者本人存有细胞在“银行”中，则可取之作为核供体。 3）获得供体细胞方法 获取患者组织，按常规机械方法、胰蛋白酶消化获得单个细胞。 4）供体细胞培养 ：按常规方法培养，增殖。 在移植前使供核体细胞同步化于GO/G1期，以增加成功率。 2. 受体(recipient)细胞 1）受体细胞的来源有三类：去核卵细胞、受精卵和2-细胞胚胎。其中以卵细胞作为受体最多。 2）受体卵细胞的准备： 卵母细胞一般来源于医院或试管婴儿多余的正常卵母细胞 可用切除的卵巢中未成熟卵泡体外培养成熟。卵细胞的数量取决于通过体细胞核移植产生的胚泡期胚胎的效率和从胚泡期胚胎获得胚胎干细胞系的难易程度。 3）体细胞与去核,卵细胞融合技术或核移植 此方法与细胞核移植技术类似，所不同的是： 1、供体细胞不一定是核，可以是含部分细胞质的细胞核甚至可以是整个细胞。 2、不进行核移植，而是用细胞融合技术，使供核细胞与去核卵细胞融合获重构胚。融合的方法有电融合、化学融合，病毒融合应用较少。 4）将病人体细胞核直接转入去核的已分离并稳定传代的ES细胞，形成杂合胚胎干细胞。目前这种方法由于存在技术及伦理上的问题，实施起来有一定的难度。 5．卵母细胞激活 在细胞融合或细胞核移植后需激活卵母细胞。 二