遗传学实验课（南京大学）免疫荧光组织化学技术 （上课用）.pptxVIP

免疫荧光技术原理及步骤; 基 本 原 理 荧光显微镜 操 作 步 骤;Albert H. Coons(1912 –1978);免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)技术，是根据抗原－抗体反应的原理，用已标记了荧光素的荧光抗体（抗原）作为探针检查组织或细胞内相应的抗原（抗体），在组织或细胞中所形成的抗原－抗体复合物上沉着有荧光素，在荧光显微镜下观察样品，荧光素受激发光的照射而发出荧光，通过荧光所在的细胞或组织， 实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。 ; 该技术将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合； 以荧光素作为标记物，与已知抗原或抗体结合，但不影响其免疫学特性； 借助荧光显微镜，直接观察呈现特异性荧光的抗原-抗体复合物及其分布。;紫外光激发荧光物质放射荧光示意图;技术特点 特异性强 敏感性高 速度快 适应性广 主要缺点是：非特异染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。;根据实验方法分类 （1）直接法 （2）间接法 （3）补体法 （4）其他法;直接法;直 接 法 ;间接法;间 接 法 ;补体法;补 体 法 ;其他免疫荧光技术;时间分辨荧光免疫测定;TRFIA的特点;荧光偏振免疫分析技术; 基 本 原 理 荧 光 显 微 镜 操 作 步 骤;显微镜的尺度;显微镜的功能;显微镜的观察方式;荧光显微镜;荧光显微镜的主要部件;反光镜：一般使用平面反光镜 聚光镜：用石英玻璃或其他透过紫外光的玻璃制成 物镜：最好使用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合荧光 目镜：多使用低倍目镜 落射光装置：既具透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。;明场：透射 荧光：落射 落射的优点：? 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。? 激发光损失小，荧光效应高。;激光共聚焦扫描显微镜;共聚焦的本质？ ------荧光显微镜 共聚焦不是万能的，它还是光学显微镜，无法突破光学显微镜的极限 共聚焦是荧光观察方式，有着荧光显微镜一切优缺点 优点：放大好；对比强；对细胞???激小；能进行多重标记 缺点：Z轴分辨率不高；荧光容易衰减和淬灭;荧光显微镜标志制作要求;荧光显微镜使用注意事项; 基 本 原 理 荧 光 显 微 镜 操 作 步 骤;（一）制 片;（二）固 定;常用抗原物质固定方法;（三）水 洗;（四）染 色;（四）染 色;;（五）结果显示;（六）标本保存;The End ！