[自然科学]葡萄糖异构酶在链霉菌的发酵生产概况.pptVIP

链霉菌葡萄糖异构酶的发酵生产概况 王海燕 112000 综述框架 葡萄糖异构酶( glucose isomerase, GI) 又称D-木糖异构酶。 1957 年最早在嗜水假单胞菌中发现其活性，后来有近百种细菌和放线菌被鉴定为产GI 的菌株。GI可催化葡萄糖转化为果糖的可逆异构化反应，能够催化D-木糖、D-葡萄糖等醛糖转化为相应的酮糖，是工业上大规模以淀粉制备高果糖浆的关键酶，也能通过偶联异构化作用及发酵作用将半纤维素转化为乙醇，在工业上有重要的经济价值，用它可生产高果糖浆。 高果糖浆是自60年代崛起的新食糖资源，味道纯正，具有较强的保温性、着色性和防腐性，营养价值较高，可不经消化直接被肠胃吸收，果糖的代谢不受胰岛素调节，糖尿病人可以利用，是饮料、糕点等食品工业的理想用糖。 高果糖浆的工业制造在全世界范围内尤其是在发达国家发展极快，现美国的高果糖浆消费量已与蔗糖持平。果葡糖浆的应用领域主要是食品工业，还有医药和饮食业，根据商业部对蔗糖消费的预测和果葡糖浆在各行业中的代用量推算， 目前我国果葡糖浆的潜在销售市场为150万吨干基。从长远观点看，果葡糖浆将成为我国一个新的主要糖源，它将从根本上解决我国糖源短缺问题。 葡萄糖异构酶的生物学性质 热稳定性 底物专一性 金属离子的影响 最适pH和最适温度 热稳定性 不同生物来源的葡萄糖异构酶热稳定性不同 乳酸杆菌和埃希杆菌GI的热稳定性较差 链霉菌和枯草芽孢杆菌GI在高温下相当稳定 嗜热高温菌GI的热稳定最高，可能是它对Val和Pro等氨基酸的偏爱选择，使其具有更紧密的空间结构，而这些氨基酸在其他GI中则被替代 底物专一性 GI除了D-葡萄糖和D-木糖以外还能以D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛糖和脱氧葡萄糖以及葡萄糖C-3、C-5和C-6的修饰衍生物为催化底物。但GI只能催化D-葡萄糖或D-木糖α-旋光异构体的转化，而不能利用β-旋光异构体作为催化底物 金属离子的影响 二价金属离子对GI的活力及稳定性影响很大 Mg2+、Co2+、Mn2+等对GI有激活作用 Ca2+、Hg2+、Cu2+等则对其起抑制作用 金属离子影响GI对不同底物的活性 凝结芽孢杆菌GI和Mn2+结合时对木糖的活性最高，和Co2+结合时对葡萄糖的活性最高 最适pH和最适温度 GI的最适pH通常是微偏碱性，大约在7.0~9.0之间。大多属种的GI在偏酸条件下活力很低 GI最适反应温度一般在70~80℃，这决定于缓冲液、底物浓度、激活剂、稳定剂及反应时间等条件。 GI基因在链霉菌中的克隆表达 葡萄糖异构酶基因序列 链霉菌中的D-木糖操纵子 GI基因在链霉菌中的表达 同源表达 异源表达 高产菌株选育及GI的改造 葡萄糖异构酶基因序列 GI的序列同源性在相近种属中较高，不同种属则较低。 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GI与链霉菌的同源性仅为24.2%和26.3% 深灰色链霉菌与紫黑色链霉菌GI的同源性为86.6%，密苏里游动放线菌和小瓶属菌株GI同源性达到93.4% 链霉菌中的D-木糖操纵子 链霉菌的D-木糖操纵子研究还不太多 在紫黑链霉菌中存在着一个调节蛋白（xylR）的阅读框，xylA和xylB基因转录方向相同。但具体的调控机制尚不清楚。 在锈赤链霉菌中，xylA和xylB基因相邻，但分开转录，方向相反 xyl基因的转录受木糖的诱导和葡萄糖的阻遏 GI基因在链霉菌中的表达 同源表达 异源表达 同源表达 在变铅青链霉菌中，同源克隆来自暗色链霉菌的GI，结果GI活性大大提高。为避免无选择压力下，由于质粒的不稳定性而造成GI的表达不稳定，还可将链霉菌启动子P1克隆到xylA的上游，再将P1-xylA基因通过整合载体pTS55整合入染色体。整合菌株CBS1在无糖条件下，GI活性大约是需要木糖诱导的野生型GI的7倍 异源表达 大肠杆菌是最常用的异源表达宿主菌。 以地衣芽孢杆菌染色体的EcoRⅠ片段克隆入pBR322，再转化GI缺陷型E.coli菌株，得到含有GI基因的重组质粒十分稳定，其酶活比野生型高20倍。 用穿梭质粒载体pSE-3将大肠杆菌葡萄糖异构酶基因在变铅青链霉菌中表达，稳定性良好。重组质粒在大肠杆菌和链霉菌中均能表达，但在链霉菌中酶活性略低于在大肠杆菌中，同时穿梭质粒载体pSE-3的新霉素抗性在大肠杆菌中比在链霉菌中高出约3倍，可能是与载体本身在这两种受体菌中的表达强度有关 高产菌株选育及GI的改造 美国 ：嗜水假单胞杆菌、短乳杆菌、 戊糖乳酸菌 日本 ：暗色链霉菌 、白色链霉菌 中国 ：玫瑰暗黄链霉菌、玫瑰红链霉菌、 高温放线菌M1033、密苏里游动放线菌 目前普遍葡萄糖异构酶生产菌种酶活