猪传染性胃肠炎S蛋白毕赤酵母表达载体的构建.pdfVIP

猪的传染病一猪传染性胃肠炎 3讨论 本研究成功地克隆了TGEvS1基因，序列比较分析结果表明，这株TGEVSl核苷酸序列同已 发表的TGEvTH98株相应序列同源性达到99．4％，说明该基因序列比较保守，可以作为TGEV基 因工程疫苗的候选基因。 本研究针对TGE免疫特点，在试验设计上，以阻断肠道传染性疾病病原感染的第一道防线为目 的，利用安全无毒的乳酸筒表达系统在肠道黏膜上粘附、定植、表达和传递抗原物质，使抗原物质 对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，冈此所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想 蝎J。作为表达和传递异质性抗原的活载体系统的乳酸乳球菌NZ3900具有许多优点，如载体对动物本 身是安全的，可合成一些生物活性物质和多种有机酸类，这监物质本身具有抑菌抗菌、抗腹泻作用 球菌Nz3900中，使得原来不能利用乳糖的乳酸乳球菌Nz3900能够发酵乳糖产酸。筛选培养基上的 溴甲酚紫遇到乳糖发酵后产的酸，由紫色变为黄色。这种利用乳糖为选择标记的表达系统，是良好 的食品级外源基凶表达系统。本研究成功地构建了TGEV部分S蛋白乳酸乳球菌表达载体系统，表 达了TGEV部分S蛋白约45kDa的目的蛋白，Westemblot和间接免疫荧光试验均表明，所表达的 外源蛋白能够与TGEV免疫衄清发生反应，表明霞组部分S蛋白有反应原性。 目前普遍认为，在宿主细胞表面表达外源抗原是活载体疫苗向黏膜免疫系统递呈抗原的最佳方 式f8l。本研究所使用的pNz8149表达载体，属分泌型表达载体。诱导表达后的活菌体免疫荧光试验 表明，表达蛋白定位于菌体的表面，为进一步开展动物免疫试验奠定了基础。 参考文献(略) 猪传染性胃肠炎S蛋白毕赤酵母表达载体的构建 康雪燕张莉 张培君 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097 按要根据m勘放TGEVs基因设计一对引物，并在5’引物和3’引物中引入＆锨I、蜘珏酶切位点，经PCR扩 鉴定阳性克隆，线性化重组穿梭质粒，电转Gsll5感受态，G418筛选克隆子。利用酵母尸把彘肠胛5fD胁真核表达系 统，表达TGEvS蛋白。 Gastmenteritisvimsof 猪传染性胃肠炎病毒(TraIlsⅡlissible swine，TGEV)可引起2周龄以内仔猪 发生以呕吐、严重急性腹泻和脱水为特征的胃肠炎，即传染性胃肠炎(TraIlsmissibleGas廿oenteritis， TGE)，具有高度的致病性和夕E亡率，给养猪业造成巨大的损失。 其中S基【大J编码纤突蛋白，S蛋白是唯一能诱导中和抗体的产生和提供免疫保护作用的结构蛋白。S 蛋白有以下方面的作用：携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇，是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫 保护作用的结构蛋白；含有宿主细胞氨肽酶受体(PAPN)的识别位点，在决定宿丰细胞亲嗜性方面起 关键作用；决定TGEV的致病性；具有细胞膜融合作用，使病毒核蛋白进入细胞浆；决定TGEv的 血凝作用。 本试验利用PCR技术扩增出S基因氨基端长为2．2Kb的片段，包含A、B、C、D四个主要抗 原位点，并克隆到pPIC9K真核表达载体上，利用酵母尸f咖缸p口妣，廊真核表达系统表达S蛋白。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1菌种和质粒 PET32a．S为本实验室构建；表达载体pPIc9K、GSl15细胞由中科院微生物所惠赠；pBs．T质 766 第十三次学术研讨会会议论文集 粒载体，感受态细胞ToPl0均购自ⅡANGEN公司。 1．1．2酶和试剂 限制性内切酶Ec口尺I、ⅣDfI、勋盯、A．所蒯Z矿d堙P盯DNAM盯l【er购自大连宅生物公司；G418为 CALBIOCHEM产品；其他试剂为国产分析纯。引物Picma 合成。质粒提取试齐J盒及DNA凝胶电泳回收试剂盒为oMEGABio．tIec公司产品；酵母基因组提取 试剂盒购自TIANGEN公司。 1．1．3培养基 LB培养基：l％胰蛋白胨，1％氯化钠，0。5％酵母浸出粉； LB+Amp培养基：LB+100p∥nllAmp。 YPD培养基：l％酵母酵母浸出粉，2％Peptone，2％D一葡萄糖 8 YPDG：YPD+G41 MD平板：1．3