检测蓝舌病病毒双抗夹心ELISA方法的建立及应用.pdfVIP

第十三次学术研讨会会议论文集 说明AKAv核蛋白基因是非常保守的。本研究的引物、探针设计是根据核蛋白基因片段非常保守的 区域，因此特异性强。荧光PCR比常规P(、R敏感，特异性相当；荧光RT．PCR具有特异性高、敏感 性强，可同时进行大量样品检测，具有高通量性；比常规PCR快速，无需扩增后的电泳分析，可减 少RNA、cDNA或PCR产物污染的风险；还可作出一个定量的、客观的估计，判定出阳性、阴性和 可疑。该研究在对长期保存在．70℃的组织、血液样品检测时发现，TaqManRT．PCR的阳性检出率比 常规RT-PCR高。分析其原因，可能是动物组织自溶或解冻时，一些病毒的I埘A被分解成小片段， RT-PCR方法也有一些不足， 于保存时间长而无法进行分离病毒的大批量样品的检测。当然，1’aqMaIl 比如1’aqMan实时定量PCR的成本高，探针对序列的变化非常敏感，对扩增目标序列的变化比引物 对靶序列的要求要高得多。 有些研究发现，有时TaqManRT-PCR检测结果无荧光信号的，用琼脂糖电泳则阳性。1aqM锄 RT．PCR失败的原因往往是探针所造成，而不是引物一J。由于PCR引物与PCR扩增片段结合，错配 也可引起扩增。相反，TaqMan探针在PCR反应中，只结合到特异部位，而不延伸。因此，探针的 R■PCR试验的关键。本研究中引物和探针的设计是定位在赤羽病核蛋白基因 设计和筛选是TaqMan 片段较保守区，这样确保了荧光R-T-PCR检测结果。 收到样品后3小时之内作出定性、定量检测结果。另外，由于本研究所建立的AKV实时荧光定量 PCR方法能检测到极微量的病毒DNA，可以对AKV进行早期诊断，及时切断其传染源，对家畜的 健康养殖具有深远的意义。目前，AKV的传播机制，以及AKV在宿主细胞的增殖过程、体内的动 态分布等还不十分清楚，本研究所建立的AKV实时荧光定量PcR方法将为以上研究提供有力的工 具。 参考文献(略) 检测蓝舌病病毒双抗夹心ELISA方法的建立及应用 杨俊兴花群义‘卢体康 吕建强秦智峰陶虹阮周曦陈兵林庆燕 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心深圳广东51800l vims，BTv)与弗氏佐剂乳化后，免疫6周龄BALB，c小鼠。分离免疫鼠 摘要将纯化的蓝舌病病毒(Bluetongue 脾细胞与sP2／0细胞融合，经BTv．ELIsA，BTv 分别检测BTv，鹿流行性出血病病毒、水泡性口炎病毒、赤羽病病毒．小反刍兽疫病毒阳性样品，用RT_PcR作对 和敏感性分别为99．1％和85．7％，两种方法的符合率为97．7％。 蓝舌病(B1uetongue BTV群特异性抗原【3】。 在很多国家动物贸易协定中，BLu是必须进行检疫的传染病之一。近年来，随着气候变暖，BLU 在欧洲许多国家的发病率增加，严重影响着国际动物贸易14】。目前，BLU血清学检测方法已有很多 报道，如琼脂免疫扩散试验、补体结合试验、荧光抗体染色试验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试 VP7单抗和兔抗BTV多抗作为材料， 验等【5】，但检测BTV的免疫学方法很少。本研究用抗BTV 建立了BTV双抗夹心ELIsA检测方法，初步应用结果表明该方法具有良好特异性和敏感性，可以 用于BTv的快速检测。 128l 牛羊马传染病 1材料和方法 1．1病毒和细胞株 BHK-2l细胞由深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心动检实验室保存。 1．2实验动物 6周龄SPFBALB／c小鼠和3月龄新西兰家兔购买于广东省医学实验动物中心。 1．3主要试剂及试剂盒 培养基，m’、HAT选择性培养基，新生牛血清：Gibco公司产品。鼠源单克隆抗体亚型检测试剂盒： HBT公司产品。蛋白～fG抗体纯化柱：Pierce公司产品。 1．4单克隆抗体的制备 1．4．1动物免疫 别100¨g、100嵋和200烬。首免时加等体积弗氏完全佐剂乳化，二免和三免时加等体积弗氏不完全 佐剂乳化【6】。三免后