棘球蚴病特异性诊断抗原的分子克隆及应用评价.pdf

中文摘要 摘 要 【目的】(1)从我国棘球绦虫分离株克隆具有较高敏感性和特异性的诊断抗原 Eml8和AgB基因，重组表达并评价其诊断价值，为用于我国棘球蚴病的诊断提供 依据；(2)筛选、克隆和表达细粒棘球蚴新抗原基因并对其诊断价值作初步评估。 【方法】(1)分子克隆技术：eDNA文库的构建、聚合酶链式反应体外扩增DNA (PCR)、质粒载体中克隆外源DNA、重组质粒的鉴定和分析、DNA凝胶电泳、 DNA序列测定、克隆化基因的表达和重组蛋白的纯化；(2)生物信息学技术：核 酸序列同源性分析、蛋白序列同源性分析、蛋白质结构和功能的预测分析、生物信 息公共数据库；(3)免疫学检测分析技术：特异性单克隆和多克隆抗体的制备、酶 【结果】从中国多房棘球绦虫四川分离株克隆了Eml8抗原全长基因并获得了 其敏感性为95．5％、特异性为93．6％；检测的抗体水平在早期与病程有一定的相关 性；分别克隆了5个含不同表位区域的Eml8片段抗原，通过对不同片段的分析研 究，明确了Eml8抗原表位免疫优势区域位于序列的前1／2—2／3。含免疫优势表位 区域的片段抗原对AE诊断的敏感性不变，特异性从93．6％提高到99．3％(ELISA)， 克隆抗体；建立单克隆抗体+多克隆抗体的混合双夹心ELISA方法，检测ReEml8 抗原的灵敏度达3ng／ml，在54．45％的AE患者血清中可检测到循环抗原。 克隆表达了中国细粒棘球绦虫新疆和甘肃分离株的AgBl和AgB2抗原亚单位 基因，并将AgBl和AgB2两个抗原亚单位基因进行联合表达；血清学评价表明， 无显著差异。AgBl与AgB2之间比较，敏感性无显著性差异，但AgB2的特异性 优于AgBl。总体评价，联合表达的重组抗原诊断效果优于AgBl或AgB2单独表 达的重组抗原；用联合表达的AgBs抗原检测分别来源于我国新疆、青海、甘肃和 四川4个不同流行区经手术或临床确诊的CE患者血清，结果表明检测敏感性在不 同省区间有显著差异。提示我国不同流行区的虫株之间存在一定程度的差异。 中文摘要 用细粒棘球蚴(虫卵和原头节)感染的鼠混合血清对细粒棘球蚴新疆源和甘肃 源的原头节cDNA文库进行筛选，共获得阳性克隆92个；选择15个克隆进行了测 序，获得了10种蛋白质基因信息，其中5种为细粒棘球绦虫新基因。本研究向 GenBank登录我国棘球绦虫的基因序列信息共计16条。 通过对cDNA文库筛选获得的10个蛋白编码基因已有研究工作的综合分析，选 择了一个新基因(钙网蛋白，克隆G10)和一个已发现的抗原基因(EpCl，克隆 X25)进行表达。表达的重组蛋白用WB法进行初步的血清学分析表明，G10和X25 重组抗原对CE血清有高特异反应性。 【结论】1)克隆了我国多房棘球绦虫分离株的Eml8抗原全长基因，表达重组 蛋白并进行了血清学评价，其诊断敏感性为95．5％、特异性为93．6％；2)通过对 Eml8抗原表位免疫优势区域的分析研究，确定了Eml8抗原表位免疫优势区域位 于序列的前1／2—2／3，获得的Eml8片段抗原诊断的敏感性不变，特异性从93．6％ 场应用评估及快速诊断试剂的研制；3)获得的Eml8单克隆抗体检测Eml8重组 抗原的灵敏度达3ng／ml，可检测到AE患者血清中的循环抗原。4)克隆我国细粒 亚单位基因进行联合表达。血清学评价表明联合表达的重组抗原诊断效果优于单基 因表达的重组抗原，但敏感性受到不同地域虫株遗传变异的限制；5)获得的细粒 棘球蚴新抗原基因(G10)，具有较好的特异性，经过进一步的优化表达，具有诊断 应用的前景。本研究为棘球蚴病特异性诊断抗原的重组、表达技术和相应诊断技术 的转化和推广应用奠定了科学基础。 【关键词】细粒棘球蚴，多房棘球蚴，诊断抗原，循环抗原，分子克隆， eDNA文库，序列分析 2 英文摘要 ABSTRACT