利用反转录聚合酶链式反应检测H5亚型禽流感病毒的研究.pdfVIP

后补论文 利用反转录聚合酶链式反应检测H5亚型禽流感病毒的研究水 张文惠王铁峰孟庆峰张宇迟媛钱爱东 130118) (吉林农业大学动物科技学院， 长春市新城大街2888号， 亚型禽流感病毒的血凝素基因序列，设计了l对针对H5亚型AIV的特异性引物，这对引物所扩增的cDNA片段大小为 427bp，并且对RT-PcR反应体系进行优化．结果：该RT-PCR对H5亚型AⅣ能扩增出I条大小为427bp的cDNA片段， 将回收产物的测序结果在BLAsT上进行序列相似性比较，提示这些扩增基因的序列是H5亚型AIV的HA基因。扩增结 果表明与其他常见禽病病原的核酸不存在交叉反应．该RT_PcR对H5亚型AIVcDNA的最低检出量为10pg。结论：成 功建立了快速检测H5亚型AIV的R●PCR技术． 关冀词：反转录聚合酶链式反应；禽流感病毒；H5亚型 禽流感病毒(AⅣ)属于A型流感病毒，除了可感染禽类外，还可感染人、猪和马等动物。AIv引 起的禽流感(AI)是一种严重危害养禽业发展的烈性传染病，被OIE列为A类传染病。特征为从低致病 性毒株引起的禽类轻度呼吸疾病、产蛋下降到高致病性毒株引起的急性致死性疫病等多种形式fl】。 AⅣ基凶组由HA基因在内的8个负链单股RNA片段组成，HA基因组则变异性很强。HA基因某些位 点的变异可导致不同HA亚型【2J。目前发现AIV有16个HA亚型，其中H5亚型常表现为高致病性，除了 给养禽业带来严重经济损失外f3t4】，还可感染人，甚至导致死亡嶂～。目前，病毒分离、血清学试验仍 是诊断AI和对AⅣ进行定型普遍采用的方法，但这些方法不仅操作繁琐、复杂和耗时，难以对AI进 行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。聚合酶链反应(PCR)是一种基因体外扩增技术，可以在数小 时内对某段基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏感性高、检测快速等特点，已广泛应用于 生物学、医学、兽医学的各个领域，在病原感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值【_7．91。 本研究建立了H5亚型AIV的RT—PCR检测技术，可对活禽及禽产品进行检测，直接定位到亚型。这对 建立快速的进出口检验检疫，为禽流感的防制提供先进、有效的诊断技术和检测手段具有十分重要 的意义。 1材料与方法 1．1试验用毒株 禽流感病毒H5亚型标准毒株由哈尔滨兽医生物技术国家重点实验室保存。鸡传染性支气管炎病 1．2生化试剂 Tfizol RNA抽提试剂、RNA酶抑制剂、A。MV、 dNrP、1硇酶、M矾澍DL2000为宝泰克生 物科技公司产品。 1．3试验设计 1．3．1引物设计与合成 域等特点，最后选定47个H5亚型AⅣ毒株的血凝素基因序列。参考上述基因序列，使用Pnmer Premier 5．0软件，设计了l对针对H5亚型AⅣ的特异性引物，见表1。引物均由沈阳联星生物技 术有限公司合成。 表l盯-P僳引物 坠垒：!墨羔堕垦巳卿 引物名称 引物寡核苷酸序列 所在位置 产物大小／bp 题坐曼!!坠垒堡曼!!堑!旦笪!Q!!gQ翌坚!!!翌垒垒!!璺g坚曼望!羔!呈苎竖坐iQ望型坠!!!曼坠世 ZH5-1 5’一CCAAllCCAGCCAATGACC·3’296 ZH5．2 5’一TCT盯GGCAACCCTTCTT_3’722 427 1．3．2病原l讯A的提取 ‘基金项目：吉林省科技厅资助重大项目 1560 第十=发学术研讨会会议论文集 参照¨z0【RNA抽提试剂使用说明书提取病毒RNA。 lj3反转录 2llL． 25删ol，L