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粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立 　　摘要：用携带植物高效表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋和发根型质粒ｐＲｉＡ４，“解除武装”的重组Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黄芩无菌苗的幼茎、子叶、叶片，诱导毛状根的表达，以建立基于粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统。幼茎毛状根诱导率最高，达８８．９％。ＰＣＲ扩增检测粘毛黄芩毛状根单克隆基因组中的ｒｏｌＣ和ｈｙｇｒ基因片段，结果表明，ｐＲｉＡ４和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋均能整合到粘毛黄芩毛状根的基因组内，共转化率达２８．１％。 　　关键词：粘毛黄芩；毛状根；共转化 　　中图分类号：Ｓ５６７．２３＋９ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８11419－4070-03 　　 　　Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ bａｓｅｄ ｏｎ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｈａｉｒｙ Ｒｏｏｔｓ 　　 　　ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆａｎｇ１，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｈｕａ１，ＳＵＮ Ｍｉｎ２ 　　 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｓａｒｍｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｃ５８Ｃ１ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲｉＡ４ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ ｓｔｅｍ， ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ． ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｈｅｄ ｕｐ ｔｏ ８８．９％． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ rｏｌＣ ａｎｄ hｙｇｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ２８．１％． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.； ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ； ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ 　　 　　粘毛黄芩是唇形科黄芩属多年生草本植物［１，２］，其药用成分主要分布于根部。药理上已证实其中的主要成分黄芩苷和黄芩苷元有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、解毒及抑制ＨＩＶ病毒逆转录酶活性等作用［３］。随着对植物代谢网络认识的加深，应用基因工程技术对植物次生代谢途径进行遗传改良已取得了可喜的进展。本研究用携带植物高效表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋“解除武装”的重组Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黄芩无菌苗的不同外植体诱导出毛状根，建立粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统，以期为其次生代谢产物黄酮类化合物的生物合成关键酶基因导入，并实现产业化大量生产奠定基础。 　　１材料与方法 　　１．１菌株及植物材料 　　重组Ｃ５８Ｃ１工程菌由西南大学廖志华教授惠赠，Ｃ５８Ｃ１本来是根癌农杆菌，经“解除武装”改造后，保留Ｈｅｌｐｅｒ质粒，导入发根质粒ｐＲｉＡ４，改造后的Ｃ５８Ｃ１失去使植物长冠瘿组织的能力，成为发根农杆菌。粘毛黄芩种子购买于山西省绛县远博农副产品公司。 　　１．２方法 　　１．２．１农杆菌的活化取保存的工程菌Ｃ５８Ｃ１菌种，划线接种于ＹＥＢ固体培养基上，２８ 培养，固体培养基上活化２次。挑取单菌落，接种于ＹＥＢ液体培养基中，２８ 、１５０ ｒ／ｍｉｎ培养过夜，当ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６时进行第4次活化，在ＯＤ６００ ｎｍ＝０．３时加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮，继续振荡培养至ＯＤ６００ ｎｍ＝０．５，室温下４ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清液，菌体用等体积ＭＳ＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ液体培养基悬浮培养，２８ 、１５０ ｒ／ｍｉｎ继续活化３０ ｍｉｎ，可用于侵染。 　　１．２．２粘毛黄芩无菌苗的获得选取饱满种子用自来水浸泡８ ｈ，然后流水冲洗５ ｈ，体积分数７５％的乙醇浸泡３０ ｓ，无菌水冲洗３次，质量分数０．１％的 ＨｇＣl２浸泡１２ ｍｉｎ，无菌水洗涤５次