8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探.docVIP

精品论文 参考文献 8种烈性中药的体外急性毒性试验方法初探 陈素珍 李瑾翡（通讯作者） 曾秋敏 （广东省食品药品检验所 510180） 【摘要】目的 比较两种体外细胞毒性方法，探讨其用于预测中药急性毒性的可能性。方法 应用3T3细胞中性红摄取实验、MTT实验检测8种烈性中药的细胞毒性，将测得的IC50值分别与急性经口毒性试验的小鼠LD50值进行比较。结果 3T3细胞MTT、中性红2种检测方法中,以MTT法的检测结果与体内LD50的相关性较好。结论 与3T3细胞中性红法相比，MTT法可较好地预测烈性中药的急性毒性，有望用于中药急性毒性的初筛实验。 【中图分类号】R28 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）22-0044-02 急性毒性试验是毒理学安全性评价的首个基础性工作，传统的急性毒性试验由于实验周期长、使用实验动物多，耗费人力物力大，越来越不能适应当前现状。且随着动物伦理和“3R”原则的贯彻实施，体外替代实验成为当今研究工作的热点。已有研究表明，化学物质的体外细胞毒性实验与整体动物实验结果有很大的相关性，有望用于化学物质急性毒性筛查[1]。本研究旨在探讨体外细胞毒性方法用于预测中药急性毒性的可能性。 1.材料与方法 1.1 试剂与仪器 8种烈性中药受试物：附子、炮附片、牵牛子、山豆根、雷公藤、制草乌、姜半夏、苦楝皮中药配方颗粒均为由某有限公司提供。 RPMI 1640培养基（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青）； MTT（广州威佳）；中性红染料（广州威佳）。 M2E多功能酶标仪；OLYMPUS正置显微镜。 1.2 溶液配制 进行动物实验时，将受试物用打粉机打碎至细粉，加温纯化水不断研磨至完全溶解；进行细胞实验时，用PBS溶解受试物，经0.22um滤膜滤过后备用。 1.3 实验动物 体重为18g～22g的NIH小白鼠，雌雄各半，共220只，由广东省医学实验动物中心（实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2008-0002）提供，合格证号：0109340。本所实验动物使用许可证号：SYXK（粤）2009-0050。 动物购进后先在实验动物房饲养2天，动物饲养室温度22℃-25℃，相对湿度60%-70%，观察合格后进行正式实验。 1.4 细胞及其培养条件 BALB/c 3T3（小鼠胚成纤维细胞）购自中国科学院上海细胞库， 细胞接种于25 cm2的细胞培养瓶中，用含10% FBS的RPMI 1640培养基在37℃、5% CO2的条件下进行常规培养。当细胞长至对数生长期时，用0.25% 胰酶进行传代或接种于96孔细胞培养板进行实验。 1.5 动物体内急性毒性实验 试验前动物禁食12小时，不禁水。试验时按性别、体重将小鼠随机分组，雌雄各半。试验当天受试物组小鼠灌胃给予相应受试物，给药剂量见表1，对照组灌胃给予等体积纯化水，给药后观察小鼠毒性反应情况，连续观察14天。若动物未发生明显毒性反应，则按最大耐受量法计算该受试物的最大耐受量；若动物发生死亡，则另取实验动物，进行LD50实验，根据实验结果计算药品的LD50值。 1.6 3T3细胞中性红摄取实验 取对数期生长的3T3细胞按1*105个/ml接种于96孔板，37℃，CO2培养箱中培养过夜使贴壁。用含5% FBS的RPMI 1640培养基配制系列溶度受试物。最高浓度为200mg/ml，以1:2梯度往下稀释7个浓度，每个浓度3个平行孔，每孔加100uL受试物孵育24h，对照孔加100uL的培养基。染毒结束后，加150uL/孔预热PBS溶液冲洗2次，再加100ul中性红培养液（1ml 25%中性红溶液+49ml含5%FBS的培养基），孵育3h后，用PBS溶液冲洗2次，再加150ul/孔中性红解吸附液（含1% 冰醋酸、49% 三蒸水和50% 无水乙醇），震荡10min（避光）后于酶标仪上读取540nm波长下的吸光度，实验重复2遍。 1.7 3T3细胞MTT实验 按1.6项方法接种、染毒，染毒结束前4h后，加20uL/孔MTT溶液。孵育4h后，移除上清液，加150ul/孔DMSO溶液，震荡10min（避光）后于酶标仪上读取490nm波长下的吸光度。实验重复2遍。 1.8 数据处理 细胞死亡率计算公式：细胞死亡率（