嗜麦芽窄食单胞菌产生的几丁质酶的特性.pdfVIP

第 29卷 第2期 华 侨 大 学 学 报 (自然 科 学 版 ) V0I．29 No．2 2008年 4月 Journal of Huaqiao University(Natural Science) Apr．2008 文章编号： 1000—5013(2008)02—0245—05 嗜麦芽窄食单胞菌产生的几丁质酶的特性 贺淹才，刘爱花，张荣奎，刘治江 (华侨大学材料科学与工程学院，福建泉州 362021) 摘要： 从土壤中筛选出一株产几丁质酶的革兰氏阴性细菌，通过 16S rDNA法对酶活力最高的菌株c进行 鉴定，确定为嗜麦芽窄食单胞菌(s．maltophilia)菌株．通过单因素优化法和均匀设计法确定 S．maltophilia 产几丁质酶的最佳条件：在pH值为7．0的基础培养基中添加质量分数为1．0 的酵母膏、质量分数为0．5 的胶体几丁质，于180 r·min_。，30℃的摇床中培养60 h．对硫酸铵沉淀获得的粗酶进行酶学性质研究，结果 表明，该几丁质酶的最适反应温度为5O℃，最适反应pH值为7．2，在55℃以上的温度条件下容易失活．通过 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确定 S．maltophilia几丁质酶的相对分子质量为6．8×10 ；以筛选的S．malto— philia菌株的总DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)扩增出几丁质酶DNA测序；应用生物信息学手段 推导S．maltophilia几丁质酶为分泌型蛋白酶，预测其等电点 pI值为5．42，相对分子质量为6．8×10 (与实 验纯化的酶蛋白电泳结果一致)．预测该酶氨基酸序列具有信号肽区(氨基酸残基 1～41)、Ⅲ型几丁质结合区 (残基47~92)、多囊肾病域(107～194)、类纤维连接蛋白Ⅲ型区(Fn3，201～278)和 18家族糖基水解域等 5 个结构功能区，5个区域被富含 Ala，Gly，Pro，Ser和Thr的短序列连接起来；在第400～500个氨基酸残基间 有一个螺旋结构． 关键词： 几丁质酶；嗜麦芽窄食单胞菌；发酵培养；分子结构；生物信息学 中图分类号： Q 814．1；Q 939．96 文献标识码： A 几丁质酶(EC 3．2．1．14)广泛分布于自然界中的各种生物体中，其生理作用涉及到生物体的生长 发育、防御病原体，甚至人的疾病发生过程[1]．它的纯品可应用于农业、医药业和轻工业_2 ]．很多种细菌 都能够产生胞外分泌型的几丁质酶[7]，但是不同细菌来源的几丁质酶有不同的分子结构和不同的作用 机理．有一种c3菌株的嗜麦芽窄食单胞菌(S．maltophilia)，它不仅能够分泌几丁质酶，同时还分泌产 生蛋白酶(EC 3．4．21—24)， 1，3-葡聚糖酶(EC 3．2．1．58)和脂肪酶(EC 3．1．1．3)_8J．嗜麦芽窄食单胞 菌产生的几丁质酶，以及其他细菌产生的几丁质酶的特性研究比较少．本文报道运用实验方法和生物信 息学方法，研究一株从土壤中筛选得到的，能够产生几丁质酶的嗜麦芽窄食单胞菌，探讨其产酶条件及 该菌产生的几丁质酶的有关特性． 1 材料与方法 1：1 菌株筛选和培养 土壤样本采自福建泉州市郊几丁质工厂的排污沟附近土壤中，样品经60目筛过筛．将土壤样本稀 释涂布在平板中，挑取可以产生透明圈的菌落，再一次通过稀释涂布的方法，将其接种于纯几丁质平板 和细菌几丁质平板上，于30℃下培养72 h，获得纯菌落平板．从第2次筛选的纯菌落平板上，选取水解 圈直径与菌落直径比最大的菌株，接种于50 mL的种子培养基(LB培养基)．培养12 h后，接种于100 mL的细菌几丁质发酵培养基中，于30℃扩大培养． 1．2 培养基 ‘ (1)筛选基培养基(质量分数)．可溶性淀粉2．0 ，KNO。0．1 ，NaC1 0．05 ，KzHPO 0．05 ， MgSO ·H。O 0．05 ，FeSO 0．001 ，胶体几丁质0．5 ，琼脂2．0 ，pH：：=7．2～7．4．(2)发酵液体 收稿日期： 2007—07—27 作者简介： 贺淹才(1949一)，男，教授，博士，主要从事生物化学与分子生物学的研究．E-mail．．yche@hqu．edu．cn 基金项目： 福建省自然科学基金资助项目(