第十章基因组与比较基因组学2012531.pptVIP

EST是长约100～300碱基对的cDNA片段，是表达基因的一部分。EST由于序列较短，很难定位，只有筛到较长的基因片段（超过1000碱基对），才能用荧光原位杂交（FISH）法在染色体上定位。　　 EST可用工业化的程序生产，只要分离到某一发育阶段某一组织的mRNA，就可用逆转录法，从mRNA合成相应的cDNA片段，即EST。用它作探针，就可从基因组文库中筛到全长的基因序列。截止到1998年2月，已发现约92万条EST，转录图的制作有了良好的开端，但这已属后基因组计划的工作。 * 人类基因组的核苷酸序列图其实是分子水平上最高层次的、最详尽的物理图。测定总长约1米、由30亿个核苷酸组成的全序列当然是人类基因组计划中最明确、最艰巨的任务（图10-10）。 因为人类所拥有的基因位点都是相同的，不同种族、不同个体的基因差异（人类基因组的多样性）以及“正常”与“疾病”基因的差异，只是同一位点上的等位基因的差异，所以，现在的人类基因组全序列来自一个“代表性人类个体”（其所有权在法律上不属于任何供体）。 五、 人类基因组的序列图 （Human Genome Sequence） 该序列在理论上代表了全人类的基因组信息，事实上也可被用于任何族群、任何个体的基因分析和诊断。人类基因组计划所提供的这四张图，特别是人类核酸序列图，蕴藏了决定我们生、老、病、死的所有遗传信息，必将成为人类认识自我、改造自我的用之不绝的知识源泉，为21世纪现代生物学和医学的迅速发展奠定基础。 DNA的鸟枪法序列分析技术 第二节 * 一、基因组DNA大片段文库的构建 二、鸟枪法基因组序列分析技术及其改良 一、基因组DNA大片段文库的构建 以YAC克隆为基础建立的邻接克隆群，由于DNA片段太大，不适于测序，需另外几种载体克隆的配合。BAC可运载约30万碱基对的片段，P1可运载约10万碱基对的片段，粘粒可运载约4万～5万碱基对的片段，细菌质粒则可运载约1万碱基对的DNA片段。这几类载体的运用，使YAC克隆的DNA大片段可先分解成相应克隆的小片段，便于测序。 一次测序一般只能测定1000碱基对，然后用已知序列的下游部分合成引物，进行另一次测序，如此一步步地“步行”，逐步完成较大片段的测序。因此，需先用质粒建立许多克隆，构成质粒文库，再对这些质粒克隆进行测序，然后用电脑搭配成邻接克隆群。　　 由于自动化和电脑的应用，现在一天已可进行10万个测序反应。现已完成的1.8亿碱基对的测序，约占人类基因组的5％～6％。华盛顿大学、贝勒医学院等机构，均已完成几百万到几千万碱基对的测序，错误率仅万分之一，测序速度和准确性已大大提高。 * 二、鸟枪法基因组序列分析技术及其改良 第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。 第二，高效、大规模的末端测序。对文库中每一个克隆，进行两端测序，TIGR在完成流感嗜血杆菌的基因组时，使用了14台测序仪，用三个月时间完成了必需的28,463个测序反应，测序总长度达6倍基因组。 全基因组鸟枪法测序的主要步骤是： 第三，序列集合。TIGR发展了新的软件，修改了序列集合规则以最大限度地排除错误的连锁匹配。 第四，填补缺口。有两种待填补的缺口，一是没有相应模板DNA的物理缺口，二是有模板DNA但未测序的序列缺口。他们建立了插入片段为15-20kb的λ文库以备缺口填补。 * *  随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各个片段重叠或一个连续体的概率是2n2-2高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。 鸟枪法测序的缺点 * (1) Clone contig法。首先用稀有内切酶把待测基因组降解为数百kb以上的片段，再分别测序。 (2) 靶标鸟枪法(direted shotgun)。首先根据染色体上已知基因和标记的位置来确定部分DNA片段的相对位置，再逐步缩小各片段之间的缺口。 对鸟枪法的改进 * 比较基因组学（Comparative genomics）及功能基因组学研究 第三节 一、通过基因组数据进行全局性分析 二、通过基因组数据进行比较基因组学研究 三、功能基因组学研究 基因组的序列主要可被分为三类： 由于生物在进化上是相互关联的，对一种生物的研究可以为其它生物提供有价值的信息。 （一）通过比较确知其生理功能的； （二）在数据库中有相匹配的蛋白质序列，但并不知道其功能的； （三）在现有数据库中找不到任何相匹配的蛋白质序列的新基因。 * ?? 比较基因组学的威力就在于它能根据对一种生物相关基因的认识来理解、诠释甚至克隆分离另一种生物的基因。 远缘基因组间的比较为认识