第十章家畜配子与胚胎生物工程2.pptVIP

胚胎细胞毒性分析 间接免疫荧光分析法 囊胚形成抑制法 免疫亲和柱层析法 H-Y抗血清直接输入法 免疫磁珠技术 培养腔前卵泡培养基主要有MEM,GMEM,TCMl99和 Wavmouth MB752/l 培养基等。 培养基中添加血清、成熟分裂抑制剂、促性腺激素、类 固醇激素和生长因子等。 培养方法有微滴法、琼脂包埋培养法、胶原蛋白铺层培 养法(二维法)和胶原蛋白包埋培养法(三维法)。 分离培养腔前卵泡研究已在小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猫、 猪和牛均有报道，并以小鼠和牛研究较多，但仅在 小鼠获得后代。 精子的预处理 浮游程序（swim up） 玻璃棉过滤程序 BSA/Percoll 密度梯度 透明质酸的作用 精子洗涤 精子浓度 精子活力的提高 咖啡因 PHE 腺苷及其类似物 血小板激活因子 谷胱甘肽 己酮可可碱和茶碱 体外获能处理方法 肝素处理 高离子强度液处理 高pH 值处理 黄嘌呤 咖啡因处理 牛卵泡液 猪卵泡液 子宫液、输卵管液 精子活力激动剂 钙离子载体处理 调整获能精子浓度，制成小滴，覆盖石蜡油，经培养30～ 60min。将体外培养成熟的卵母细胞加入与之共孵育。精 卵共孵育时间与受精体系有关。洗去多余精子和卵丘 细胞，转移至受精卵培养液中继续培养。受精卵标志 是雌、雄原核，排出第二极体，或发育到卵裂期胚胎。 显微受精(micro fertilization)。它是利用显微操作仪将精子直接 注入卵母细胞内，使精卵结合的生命过程，已在小鼠、 兔、牛和人类取得成功并获得后代。 卵母细胞的来源和成熟状态； 精子来源和密度、精子的活力； 培养基的选择； 受精滴的大小； 精卵比例； 精卵相互作用时间、湿度、温度和气相等； 利用成分确定的合成液：添加血清、BSA、维生素和氨 基酸、丙酮酸钠等物质，便于研究 发育过程中某一 种物质对胚胎的作用机制，有助于了解胚胎早期发 育和代谢机理，但囊胚发育率不高。 分步培养法：根据胚胎发育不同生长阶段对不同物质和 代谢不同，采用不同培养液进行培养，包括含血清 和／或BSA的蛋白培养体系和无蛋白培养体系。屠 宰场收集的牛卵母细胞经体外培养至成熟，体外受 精得到受精卵采用半确定培养液两步培养系统．其 桑椹胚发育率高达50％。 利用辅助细胞或饲养细胞(主要有输卵管上皮细胞、颗粒／卵丘细胞、子宫内膜细胞、肾细胞、成纤维细胞和水牛、大鼠肝细胞BRL等)在体外与受精卵共同培养促进胚胎发育可得较高的囊胚发育率。 共同培养中仍存在选择何种体细胞最适宜，是否存在特异性或非特异性胚胎生长因子等。由于体细胞的加入，使培养液成分更加复杂，很难从中分析出影响培养效果的具体因素，而且胚胎和体细胞对培养的各种条件要求不一，故尚未有令人满意的结果。 毛细管吹吸法 显微手术法 徒手分割法 免疫手术法 2-细胞到8-细胞分割胚的发育 桑椹期和囊胚期分割胚的发育 胚胎分割的时期 胚胎的分割程度 透明带的有无 分割胚的培养条件 胚胎性别 移人受体的胚胎数 分割胚的保存 胚细胞核移植 构建异源重构胚胎 研究遗传-环境相互作用 产生嵌合体 产前诊断 提高体外受精的妊娠率 这种方法主要适用于分离2-细胞到8-细胞期卵裂球。 在显微操作仪的帮助下，在无钙、镁离子的培养液中，用固定针吸住胚胎，用另一玻璃针挑开胚胎的透明带，细胞团自透明带中脱出。再用仅能通过胚胎的毛细管吹吸胚胎，得到单个卵裂球，再将卵裂球装入空的透明带中，体外培养至一定时期，移植入受体中。 这种方法主要适用于分割桑椹胚和囊胚。 在显微操作仪的帮助下，以固定针吸住胚胎，用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。 在切割桑椹胚时，需在不含钙、镁离子的培养液中，以降低细胞间的连接，降低由于切割造成的损伤。 对胚胎的分割要注意对称，尤其是囊胚，要注意将内细胞团对称地一分为二。 徒手分割法主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。 在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。 这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。 免疫手术法利用处于囊胚期的胚胎其滋养层细胞之间已形成紧密连接，能阻挡外部抗体分子进入囊胚腔。 方法：将胚胎置于抗血清中，使滋养层细胞与抗体分子充分结合，然后在补体的协助下，利用免疫反应，溶解外层的滋养层细胞，而未结合抗体分子的内细胞团则保持完整。这样分离的内细胞团可注射人另一胚胎的囊胚腔中，或与处于桑椹期的其他胚胎整合，这样可产生嵌合体。 对早期胚胎细胞，先用1%的链酶蛋白酶或pH2.5的台氏液去掉透明带，再用机械吹打或酶消化法使其分散为单个游离的卵裂球。 体细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将细胞接种培养于DMEM/F12培养中。后放