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3730XL测序基本流程;准备模板：质粒、PCR产物 电泳鉴定DNA浓度和质量 测序PCR反应 纯化测序产物（上机前纯化） 上机 分析数据;洛末怪此檀冻瑟诱传提椿烤牟骏会文钝吾坏豌锤挠啤捏蔡喂涵冶酱扦乏叮3730测序程3730测序程; 一 质粒DNA的提取;碱裂法提取质粒操作步骤;溶液I的组分：1.0M Tris-HCl / 0.5M EDTA，pH8.0，用前按比例加入RNase酶 溶液I的作用：菌体悬浮 EDTA是在溶液I中主要起抑制DNase的作用 。 如果缺了溶液I，我们也可以用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体。 特别注意：菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。; RNase酶未加或失活;溶液II的组分： 0.4 N NaOH / 2% SDS； 两种溶液等体积混合后使用 ，必须现用现配 溶液II的作用：裂解作用 溶液II在天气冷时会产生絮状沉淀，可温水预热至沉淀消除。 SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是： a.溶解细胞膜上的脂质与蛋 白，从而破坏细胞膜。 b.解聚细胞中的核蛋白。 c.能使蛋白质变性而沉淀下来。; 这一步要注意两点： 第一，时间不能过长，尽量不要超过5min。因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂； 第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。;超螺旋结构;溶液III的组分：3 M 乙酸钾 ， 冰乙酸调PH值至4.8～5.2。 溶液III的作用: 中和作用 3mol/L pH4.8~5.2的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。 溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS(十二烷基硫酸钾potassium dodecylsulfate);13000rpm 4℃离心10min，沉淀蛋白;;好图;对DNA的纯度要求;;三 测序的PCR反应; ABI BigDye 3.1的组成成分 测序酶 脱氧的dNTP 双脱氧的dNTP(荧光标记) Mg2+ ddH2O buffter ;DNA测序模板用量;引物与模板的平衡最关键; 为什么要定量 浓度太低：会导致反应不充分，测序信号较弱。 浓度太高： 1.会导致小片段进样过多，信号迅速衰减（见下图）。 2.DNA中包含较多杂质，会对后续测序反应产生影响。;PCR与测序反应的比较;四 测序产物纯化（上机前纯化）;电进样对DNA纯度的要求;举例 酒精/EDTA/NaAc法 每管加入1 ?L 125 mM EDTA，1 ?L 3 M NaAc，到管底； 每管加入25 ?L 无水乙醇，用胶垫封严密，震荡2－3min， 室温放置15 min； 4300 rpm离心30 min，立即倒置384孔板离心，至300rpm 停止，去除酒精； 每管加入35 ?L 70% 酒精， 4300 rpm 4 ?C离心15 min， 立即倒置384孔板离心，至300 rpm停止，去除酒精； 重复70% 酒精洗涤1次； 让残余的酒精在室温挥发干，加入10 ?L Hi-Di甲酰胺， 95 ?C变性4 min，迅速冰冷4 min ，上样电泳。;ABI 3730xl 自动测序仪外观图;阳极缓冲液瓶;96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架;六 测序结果的分析处理;测序结果峰图文件;Thanks!