荧光定量PCR检测饲料中牛羊源性成分方法的建立.pdfVIP

荧光定量PCR 检测饲料中牛羊源性成分方法的建立 摘 要 疯牛病对全球的畜牧养殖业以及人类健康产生了巨大的危害，流行 病学调查证明疯牛病、羊痒病都是由朊蛋白（prion）引起，并通过食 物链传染而传播，并与人新型克－雅氏症的发病有关。研究证明，用患 有疯牛病和羊痒病的牛、羊等动物的肉和骨头制成的肉骨粉喂养动物会 导致疯牛病和羊搔痒病的传播，因此包括我国在内的世界各国严令禁止 使用反刍动物蛋白饲料饲喂牛、羊等动物，由此也产生了对饲料中是否 含牛、羊源性成分进行检测的必要。 目前国内外对于饲料中反刍动物源性成分的检测方法的报道主要 有显微镜检、红外光谱、普通 PCR、ELISA 等，但这些方法存在检测量 小、易产生假阳性结果、要求检验人员有丰富的操作经验等缺点，需要 建立一种更快速、准确和经济的方法，而荧光定量 PCR 法正是一种可以 满足这些要求的方法。 本论文从以下三个方面对这一方法进行了研究：1 饲料中牛、羊成 分 DNA 的提取及净化条件 2、实时荧光定量 PCR 的反应条件 3 方法的特 异性、灵敏度及稳定性，通过解决了样品 DNA 提取的时间、温度、试剂、 特异性引物及探针序列、PCR 反应变性、退火、延伸温度和时间及循环 次数等关键性问题而成功建立了实时荧光定量 PCR 法检测饲料中牛、羊 源性成分的方法。 实时荧光定量 PCR 法不仅很好的解决了普通 PCR容易污染的问题， 还具有特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测成本低等优点，为饲料安 全监督提供了准确、有力的实验证据和方法。 关键词：荧光定量PCR，牛羊骨粉 RESEARCH OF METHOD FOR DETECTION OF BOVINE AND SHEEP/GOAT MATERIALS IN ANIMAL FEEDSTUFFS BY REAL-TIME FLUORESCENCE QUANTITIVE PCR ABSTRACT Bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie have do harm to the health of human being and animals and cause huge damage to the global stockbreeding. The epidemiologic survey has proved that this disease caused by prions can be transmitted through food chain and is related to Creutzfeldt-Jakob Disease. The theory of feed-borne contamination through infected ruminant protein being the major vehicle for the transmission of BSE in cattle has been widely supported by studies, so many countries including China enforce the ban on meat-and-bone for farmed animals and it is necessary to detect the ruminant proteins in feedstuffs. Now there are four different analytical methods currently applied in the world for the detection and identification of animal tissues in feed including our country, i.e. microscopic analysis, polymerase chain reaction, immunoassay analysis an