缺氧诱导因子-1α在乳腺癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响论文.pdfVIP

的表达与 Ki67 指数相关，但也有不同的研究认为 HIF-1α与细胞增 殖无关,因此对于HIF-1 与 Ki67 的相关性有待进一步研究。故本研究 采用免疫组化方法检测乳腺癌中 HIF-1α和Ki67 的表达情况，以研 究分析这两个指标表达的相关性，并初步探讨 HIF-1α对乳腺癌细胞 增殖的影响。 1 材料与方法 1.1 临床病例资料 取 70 例乳腺癌组织标本来自 2008-2010 年间在我院手术治 疗后存档并留有病理标本的的患者。病例均为女性，年龄在 25-78 岁 之间，平均年龄（38.32±10.09）岁，术前均未接受过放疗、化疗及 内分泌治疗。所有病例均经病理科确诊。TNM 分期参照 2010 年 AJCC 第七版肿瘤分期，，其中 Ⅰ期 17 例，Ⅱ期 41 例，Ⅲ期 12 例。淋巴结 转移情况:转移≥4 个 21 例,转移少于 4 个 17 例,无转移 32 例 (病人 受检淋巴结总数均在 10 个以上)。组织学分级情况： Ⅰ级 32 例，Ⅱ 级 34 例，Ⅲ级 4 例。同时，在上述乳腺癌患者的组织标本中选取远 离肿瘤边缘（约 2cm）的乳腺癌旁正常组织（镜下无癌）设为癌旁组 织对照组，另取 10 例乳腺良性肿瘤组织设为良性肿物对照组，标本 亦来自 2008-2010 年间在我院手术并留有病理标本的患者。病例均为 女性，年龄在 41-46 岁之间，平均年龄（45.67±6.74）岁，对照组 病例亦经病理科确诊。 1.2 方法与步骤 1.2.1 方法 本实验所采用染色方法是快捷免疫组化 HRP 法（MaxVision 2/HRP）, 标本经 10%的福尔马林固定，常规脱水包埋，做厚度 3-4μm 的连续 切片、脱蜡和水化。鼠抗人HIF-1α 单克隆抗体（即用型）及兔抗人 Ki67 单克隆抗体（即用型）均购自福州迈新生物技术开发有限公司， TM 免疫组化步骤严格按照 MaxVision 试剂盒说明进行，PBS 代替一抗作 阴性对照，检测每例样本的HIF-1α 和 Ki67 的表达情况。 1.2.2 具体染色步骤 TM 即用型快捷免疫组化 MaxVision 试剂盒是根据聚合物技术把过 氧化物酶与抗鼠/和抗兔 lgG 分子结合在多聚物上形成多聚物分子。 其染色步骤如下： ①、石蜡切片脱蜡和水化后，用 PBS （PH7.4）冲洗三次，每次 3 分 钟（3×3′）。②、根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的 修复。 ③、如有必要（内源性过氧化物酶含量高的组织），每张切片加 1 滴 或 50μl 3%过氧化氢溶液，室温下孵育 10 分钟，以阻断内源性过氧化物酶 的活 性。PBS 冲洗 3×3′。 ④、甩去PBS 液，每张切片加 1 滴或 50μl 的第一抗体（用户自选）， 室温 下孵育 60 分钟或 4℃过夜，建议参阅每种抗体的说明书。 ⑤、PBS 冲洗 3×5′。甩去PBS 液，每张切片加 1 滴或 50μl 即用型 TM MaxVision 试剂，室温下孵育 10-15 分钟。 ⑥、PBS 冲洗 3×3′。 ⑦、甩去 PBS 液，每张切片加 2 滴或 100μl 新鲜配制的 DAB 或 AEC 溶液， 显微镜下观察 3-5 分钟（DAB），或 10 分钟（AEC）。 ⑧、自来水冲洗，苏木素复染，PBS 或自来水冲洗返蓝。如果 DAB 显 色，则 切片经过梯度酒精脱水干燥，（二甲苯透明），中性树胶封固。如 果用 AEC 显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 1.3 结果判定标准 HIF-1α 蛋白以肿瘤细胞的细胞核或细胞浆内有棕黄色细胞 颗粒为阳性,肿瘤细胞无阳性反应为阴性。Ki67 以肿瘤细胞的细胞核 内出现棕黄色颗粒为阳性,无棕黄色颗粒出现或仅出现于胞浆内为阴 [6] 性。按照 Bachtiary 的方法，高倍镜下（*400）随机选取5 个视野， 每个视野计数 200 个细胞，共 1000 个，染色弱者、清晰者、强者分 别记为 1、2、3 分；阳性细胞数1.0%为 0 分，1.0%～10.0%为 1 分， 11.0%～50.0%为 2 分