姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制讨论.docVIP

姜黄素对骨髓瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制讨论 　　多发性骨髓瘤( multiple myeloma，MM) 是一种起源于B 淋巴细胞系并能够产生单克隆免疫球蛋白( M 蛋白) 的恶性增生性疾病，中老年人易患，是血液系统第二大常见恶性肿瘤。MM 的发病是一个极其复杂的病理生理过程，其中遗传学异常、骨髓微环境、细胞因子网络，在MM 的发病机制中起着重要作用。 　　姜黄素( curcumin) 是从草本植物姜黄的根茎中提取出来的酚类色素。近年被证实其主要药理作用是通过调控特定的靶基因如生长因子、转录因子等发挥抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗脂质过氧化、抗病毒等作用。已有报道姜黄素能抑制人体多种肿瘤细胞的生长，包括小细胞肺癌、卵巢癌、肾癌、前列腺癌等。不同的肿瘤细胞系涉及不同的机制。姜黄素对骨髓瘤细胞的作用主要集中在其抑制肿瘤细胞的生长、增殖及促进凋亡，但对其迁移侵袭能力并无相关研究。含IQ 模序的RasGTP 酶活化蛋白1 ( IQ motif-containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1) 是一个细胞骨架结合蛋白，通过接收和发射各种信号调节细胞迁移和细胞间黏附，促进细胞的迁移。我们的前期工作已证实IQGAP1 在骨髓瘤细胞中表达增高。IQGAP1 是否在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中起到重要作用? 姜黄素是否能对IQGAP1 在骨髓瘤细胞的迁移和侵袭中发挥的作用有抑制或阻断? 本研究期望为MM 的临床治疗提供新思路及实验依据。 　　材料和方法 　　1 主要药品和试剂 　　姜黄素( Sigma) 用二甲基亚砜配成8 mmol /L 储存液，使用前用无菌PBS 稀释至工作浓度。RPMI-1640 培养液为Gibco 产品，胎牛血清( fetal calfserum，FCS) 购自杭州四季青生物公司，其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。Matrigel 胶购自Becton Dickinson。Costar 3422 Transwell 小室购自Corning。 　　2 主要方法 　　2. 1 细胞株的培养人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226由温州医学院内科实验室长期保存，实验前从- 196 ℃液氮罐中取出，快速复苏后用用含10%FCS 的RPMI-1640 培养液重悬后，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，每2 ～ 3 d 换液1 次。选择对数生长期细胞进行实验。 　　2. 2 IQGAP1 沉默及转染RPMI8226 细胞参照文献选择RPMI8226-shIQGAP1 ( clone 1 ) 沉默IQGAP1。 　　2. 3 IQGAP1 蛋白的检测 　　2. 3. 1 质粒转染RPMI8226 细胞后，收集RPMI8226-shIQGAP1 组、RPMI8226-shRNA 阴性对照组和RPMI8226 组细胞，行2. 3. 3 步骤实验。 　　2. 3. 2 取对数生长期细胞，按1 times; 109 /L 密度接种于6 孔板内。姜黄素0、20、30 及40 mu;mol /L 作用RPMI8226-shIQGAP1 组、RPMI8226-shRNA 阴性对照组和未转染RPMI8226 组细胞24 h，行2. 3. 3 步骤实验。 　　2. 3. 3 抽提蛋白，电泳，转膜，经5% 脱脂奶粉封闭后，与1∶ 500 稀释度的抗IQGAP1 抗体和适宜稀释度的Ⅱ抗( 羊抗鼠Ig-HRP) 孵育，经Odyssey 显色系统显色，收集蛋白印迹图。 　　2. 4 迁移能力的测定 　　2. 4. 1 取对数生长期细胞，按1 times; 109 /L 密度接种于6 孔板内。细胞分为姜黄素0 mu;mol /L 组、20mu;mol /L 组、30 mu;mol /L 组和40 mu;mol /L 组，亚组分3组: RPMI8226-shIQGAP1 组、RPMI8226-shRNA 阴性对照组和未转染RPMI8226 组，每组设3 个复孔。培养箱中培养24 h 后行2. 4. 2 步骤迁移实验。 　　2. 4. 2 将0. 8 mu;m 孔径的Transwell 小室套入24 孔板中，上腔中加入200 mu;L RPMI-1640 培养液，37 ℃放置1 h。收集各组细胞，用无血清培养液洗涤和重悬各组细胞，并将细胞浓度调整至1 times; 109 /L。小心弃除Transwell 小室中的培养液，均匀加入200 mu;L 各组细胞悬液至小室上腔。通过间隙加入600 mu;L 含10% FBS 的RPMI-1640 培养液至下腔，避免产生汽泡，培养箱培养48 h 后将Transwell 小室取出。分别收集各组穿过滤膜进