七叶皂苷钠对大鼠脑出血后神经元Bax 、Bcl―2表达的影响.docVIP

七叶皂苷钠对大鼠脑出血后神经元Bax 、Bcl―2表达的影响 　　【摘 要】目的：研究大鼠脑出血后脑神经元Bax（x蛋白基因）、Bcl-2（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）的表达及七叶皂苷钠的干预作用。方法：采用Ⅶ型胶原酶脑内立体定位注射诱导大鼠脑卒中模型，60 只SD 大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、七叶皂苷钠组。选择术后1 d、3 d、7d 3个时间点处死大鼠后取脑，每点5 只。采用免疫组织化学SABC 技术，检测出血灶周围脑组织Bax 、Bcl-2蛋白的表达。结果：①模型组血肿周围Bax 、Bcl-2蛋白免疫反应阳性细胞1d 出现，3d 达最大值，7d 仍有表达（P0.01）；②七叶皂苷钠组与同时间模型组比较，Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 升高（P0.01）。结论：Bax 、Bcl-2参与了脑卒中神经元凋亡的过程，前者诱导和加重了神经元凋亡，后者有抑制凋亡作用；七叶皂苷钠可以下调Bax 表达， 上调Bcl-2 表达， 阻止神经元的凋亡。 　　【关键词】脑出血；大鼠模型；细胞凋亡；七叶皂苷钠 　　【中图分类号】R527 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0017-03 　　脑出血是一个严重危害人类健康的公共卫生问题，占所有住院脑卒中患者的10%～30%，可导致严重的残疾和高病死率，6个月的病死率达30%～50%[1]。细胞凋亡作为一种基因调控的细胞死亡方式参与了缺血性脑组织损伤过程[2]。Bcl-2基因家族在调节细胞凋亡中发挥重要作用。Bcl-2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl-2基因家族中重要的凋亡促进基因，其基因 产物Bcl-2、Bax是重要的凋亡调控蛋白。七叶皂苷钠具有提高静脉张力，改善微循环，恢复毛细血管通透性的作用[3-5]，它的溶栓，抗凝，降血粘度等功能不仅对已发生的血栓起治疗作用[6]，同时也能抑止进展型急性脑梗塞血栓的进一步发生，发展，从而避免病情进行性加重。检测大鼠脑出血后脑神经元Bax、Bcl-2的表达情况对于研究脑出血后组织损伤机制具有重要意义，探讨七叶皂苷钠对神经元Bcl-2、Bax表达的影响，有助于研究脑出血后保护神经细胞的方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，清洁级，体质量250～300g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：20-001。 　　1.1.2 药物与试剂 七叶皂苷钠注射液（ 麦通纳） ，山东绿叶制药有限公司生产， 生产批号（ 2000510444） ；胶原酶（Ⅶ型，Sigma公司产品）；一抗，SABC免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒，均购自武汉博士德生物公司；其余试剂均为国产分析纯级。 　　1.1.3 仪器 962-A型鼠脑定位仪，美国产。LAICA光学显微镜，德国产。Motic显微图像分析仪，Motic（中国）生产。飞鸽牌微量进样器，上海医用激光仪器厂生产。温度监测仪：XMD52208RS485万能通道巡检仪和Pt100电热阻，南昌百特公司生产。 　　1.2 方法 　　1.2.1 动物分组及给药方法 60只SD大鼠随机分为4组，每组15只： （A）正常组；（B）假手术组；（C）脑出血模型组；（D）七叶皂苷钠组。每组再随机分到术后1d、3d、7d 3个时间点内。给药方法：A组生理盐水2mL/d腹腔注射；B组术后生理盐水2mL/d腹腔注射；C组术后生理盐水2mL/d腹腔注射；D组术后注射七叶皂苷钠10 mg/（ kg?d） ， 溶解于2 mL 生理盐水中腹腔注射， 第1 天于手术4 h 后开始治疗；各组于术后1d、3d、7d分三批各处死5只动物，收集包含血肿的脑组织标本进行各指标的检测。 　　1.2.2 动物造模 参照Rosenberg方法[7]。步骤：①大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（400mg/kg）麻醉后；②取俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上；③局部消毒，切开皮肤，暴露颅骨，钻孔，在前囟后1.4mm，矢状缝向右3.2mm处垂直进针5.6mm，定位于苍白球，④以微量进样器缓慢注入0.4u Ⅶ型胶原酶的灭菌生理盐水2?l，留针5min，缓慢拔出针头，缝合皮肤。假手术组前③步骤方法相同，第④步骤注入灭菌生理盐水2?l。 　　1.2.3 脑组织标本采集 各组动物分别在相应的时间点用10%水合氯醛（400mg/kg）深麻醉大鼠后，迅速断头取标本置于4%的多聚甲醛中固定24h，脱水后石蜡包埋，用石蜡切片机以冠状切面连续切片，每片厚约5um，贴于明胶化玻片上，以作免疫组化用。 　　1.2.4 免疫组织化学 切片脱蜡至水，滴加3%H2O2液（室温10min），蒸馏水洗3次，微波修复抗原，滴加山羊血清封闭液，室温20min甩去多余液体不洗。滴加1：100稀释的一抗，4℃过夜，PBS洗