仿刺参纵肌带的生及相关基因表达分析.pdf

MASTERAL DISSERTATION Longitudinal Muscle bands Regeneration and Related Gene Expression Analysis in Apostichopus japonicus Supervisor: Professor Li Xia Master Candidate: Zhao Lina College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University Dalian, P.R.China June 2013 摘要 摘要 仿刺参在不良环境条件下，如海水污染、水温过高、过分密集或某些强烈的刺激时， 会引发身体收缩，泄殖腔破裂，把部分或全部内脏排出体外。这是仿刺参抵御敌害和应激 环境的一种自保措施，它们有较强的再生能力，去除体内的某些器官之后并不会死亡，而 能完整的再生出新的器官。由于仿刺参这种很强的器官再生和修复能力，及其在生物分类 上重要的进化地位，研究仿刺参的再生机制具有很高的科研价值，对于高等生物的细胞分 化与增殖、组织修复机制有重要意义。 (1) 以仿刺参为试验材料参考人类外科缝合技术，尝试对仿刺参手术部位进行缝合，建 立了一种海参体壁手术缝合的方法。结果取得理想效果，有效解决了海参创伤后伤口难以 愈合、化皮死亡的问题。将仿刺参放在盛有0.54mol/L 的硫酸镁溶液的解剖盘中麻醉 1h， 然后用灭菌手术刀沿腹部后1/3 处往前纵向切开约2cm 切口，深至体腔。采用单纯对合缝 合法进行缝合，缝合后放回加有 100IU/ml 的青霉素和100g/ml 的链霉素的抗生素的水槽 中培育。结果：试验组仿刺参缝合后，创口在10d 时已基本愈合，20d 时与正常组织没有 区别，且在培育过程中，化皮率 10%，死亡率仅 5%；对照组未经缝合，其创口愈合时间 较试验组平均慢10d，且化皮率高达58.7%，死亡率51.7% 。该方法可应用到海参的创伤实 验研究以及养殖生产中。 (2)采用人工创伤的方法先将仿刺参腹部剖开1cm 左右伤口，用剪刀横向剪断体腔背部 的纵肌带(longitudinal muscle bands, LMBs) ，然后对伤口进行缝合，并将创伤仿刺参在添加 抗生素 （100IU/ml 的青霉素和100ug/ml 的链霉素）的海水中继续饲养。用组织切片的方法 观察仿刺参纵肌带再生的形态学和组织学的变化。再生的形态学变化是创伤时，由于纵肌 带的收缩，断端出现0.5cm-1cm 的间隙；创伤15d，创伤处出现乳白色絮状组织，暂命名 为肌前组织；创伤30-45d 时，肌前组织逐渐增厚并将断端肌肉组织连接起来；创伤60-90d， 肌前组织已转化成纵肌带，并且其厚度增至约正常纵肌带的 1/2；创伤后 110-130d，新生 纵肌带进一步增粗，形态上与未创伤处组织没有区别，只是直径略小一些；创伤150d 时， 再生的纵肌带增厚至正常状态。其组织学变化过程为创伤后 15d，在损伤处出现结缔组织 及单个的肌纤维, 形成一条不规则的细长的条带，即肌前组织；创伤后 30-45d ，肌前组织 层增厚，并与体壁间形成一些通道，通道由结缔组织和体腔上皮细胞组成，结缔组织中肌 纤维的数量大量增加；创伤后60-90d，肌前组织明显增粗，几乎被肌纤维占据，且通道数 量增加，此时肌前组织已转化为肌肉带（纵肌带）；创伤后 110-130d，新生肌纤维数量大 量增加，和体壁相连的通道数量减少，创伤150d，新生的纵肌带基本达到正常的结构，且 通道基本消失。分析认为新生的肌细胞来源于体壁结缔组织细胞和体腔上皮细胞。 (3)利用实时荧光定量PCR 对仿刺参延伸因子1α （elongation factors 1α,EF1α ）基因的 表达进行定量分析，发现EF1α mRNA 在创伤处理后的纵肌带中各时间点表达明显升高， EF1α 在2d 表达水平明显增高，表达量是对照组（0d ）的30493 倍(P0.01) 。其他时间点