伪狂犬病毒pk因缺失转移载体的构建和表达.pdf

伪狂犬病毒PK基因缺失转移载体的构建和表达 摘要 virus 伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(pseudorabiesPRV)引起的家畜和多种野 生动物的一种以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病为特征的急性传染病，妊娠母 猪可发生死胎和流产，是危害养猪业的一个重要传染病。PRV作为一种疱疹病毒， 拥有庞大的基因组和许多非必需区，具有用作表达外源基因的巨大潜力，被认为 是理想的活疫苗载体。PRV的蛋白激酶(PK)基因是PRV体外生长和复制的非必需 基因，却是病毒神经毒力的必需成分。通过诱变或基因工程技术使PK基因灭活 后，病毒的毒力显著降低，但其免疫原性没有改变，因此PK基因是外源基因的 理想插入区之一。 本试验以伪狂犬病毒TK／gI缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA，用限 制性内切酶Asc I酶切基因组获得含完整PK基因的8．7kb片段，将此片段克隆 入pPolyII载体的Asc I多克隆位点获得中间载体P8_AA。用限制性内切酶sph I+Nde I缺失质粒P8一从中PK基因的2218bp片段，在此缺失区插入质粒 pEGFP_G中含绿色荧光蛋白基因和狂犬病病毒糖蛋白基因(G)的完整表达盒。 质粒缺失PK基因之后在其缺失部位克隆入EGFP基因的完整表达盒构建出通用转 移载体P8一EGFP(正)和P8一EGFP—r(反)质粒。 板上做瞬时转染，观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果质粒pEGFP．c1，pEGFP．G， 表达，因此作为通用转移载体是可行的，可以用于同源重组。同时也说明质粒 P8一EGFP和P8．EGFP—G的两侧同源重组臂中存在负调控序列，抑制了正向质粒 的EGFP基因表达，至于负调控序列的位置和作用机理还有待于进一步研究。将 PRV TK屈I缺失疫苗株基因组DNA与转移载体P8一EGFP-G—r DNA共转染PK一15细 胞，出现病变后在荧光显微镜下观察到绿色荧光，经三次蚀斑克隆纯化筛选到重 组病毒，将重组病毒命名为PRv—PK一_G。 关键词：伪狂犬病毒； PK基因； 转移载体 Constructionand ofRecombinantPRV Expl’ession Vbctor PKGeneDdetedTransfer Abstract diseaseisanacuteinfectiousdiseaseandchafacteristicastbVer Aujeszky’s andnervous dkeaseIt caninfectlivertockand otheranimals system many Pseudorabies thecausatiVeof resulls Virus(PRV)isagentA埘eszky’sdlsease，Ⅵ，hich in lossesin is themain Protein oneof significampighusbandrykinase(PK)gene Vifulemof andisessentiaJtothe PRVinthenefve genesPRV it of propagation