传染性支气管炎毒纤突蛋白、核蛋白基因的克隆、表达及其在抗体检测中的初步应用.pdf

传染性支气管炎病毒s1，NP基因的克隆表达及其在抗体检测中的初步应用 传染性支气管炎病毒纤突蛋白、核蛋白基因的 克隆、表达及其在抗体检测中的初步应用 摘要 鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis (Infectious virus，IBⅥ引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。各种年 龄、类型的鸡均易感。该病呈世界分布，是严重危害养鸡业的重大传染病之一。传 染性支气管炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，为不分节段的单股正链RNA病毒， 包含至少3种结构蛋白基因；纤突蛋白(S)基因、核蛋白(N)基因、膜蛋白(M) 基因。IBV的s蛋自由sl蛋白和s2蛋白两部分组成，在病毒进化中最为活跃，是 最重要的保护性抗原，能刺激机体产生中和抗体，在病毒吸附细胞过程中发挥重要 作用，在血清学分类、疫苗免疫防治上起决定性作用；N蛋白进化上最为保守，主 要与基因组核酸的包裹、RNA的复制和细胞免疫有关，含有大量抗原决定簇，免疫 原性仅次于S蛋白，能诱导机体产生大量抗体。自1931年发现该病以来，至少已有 二十九种血清型被报道，并且新的血清型和变异株仍在不断出现。鉴于此，通过克 隆表达具有高度保守性的N蛋白基因，并其为诊断抗原建立检测IBV抗体的ELISA 法，为监测群体的抗体水平，预防和控制该病提供可靠的依据和有效的技术保障。 同时克隆、表达具有型特异性的S1蛋白基因以便为下一步研究该病的基因工程疫苗 奠定基础。本课题的主要研究内容包括： 1、传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因和核蛋白基因的克隆与序列分析 增片断分别克隆到pMDl8．T载体．经酶切和序列测定，S1、N基因片断大小分别为 基因与H52毒株LKQ3同源性为97％。 2、传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因和核蛋白基因在大肠杆菌中的表达 s1分子量大约为80kDa；N蛋白表达于细胞质中，有两种主要产物，大小分别为 80kDa和60kDa，并利用GST亲和层析柱进行了纯化，获得了相应纯化产物， 的免疫学活性。 3、基于重组N蛋白的IBV抗体ELISA检测方法的建立 传染件支气管炎病毒s1、NP摹因的克降表达及其在抗体榆测中的初步应用 以纯化N蛋白作为包被抗原，建立了检测传染性支气管炎抗体的间接ELISA方 法。抗原最佳包被浓度为1．75¨g／mL，待检血清最佳稀释度为1：80，二抗最佳工作 浓度为1：6000。以NP．ELISA分别检测禽流感、鸡新城疫、鸡传染性法氏囊、鸡 减蛋综合症标准阳性血清和标准阴性血清，结果全部为阴性，表明该方法与其它禽 类病原抗体无交叉反应；重复性试验表明批内批间重复的吸收变异系数均小于10％。 对144份鸡血清同时用该方法和血凝抑制试验(HI)进行了检测，结果表明，特异 方法对400份被检血清进行了检测，阳性率达89．O％，表明本方法具有特异性强、 灵敏度高、方便快速的特点，可用于临床样品中IBV抗体的快速检测。 关键词：传染性支气管炎病毒；纤突蛋白；核蛋白；表达；ELISA。 、 Ⅱ 传染性支气管炎病毒SI、NP摹囡的克隆表达及其在抗体检测中的初步应用 Abstract Avian all contagious disease bronchitis(IB)isacute，highly respiratory infectious mused bronchitis whichall ofchickensarc byInfectious virus(IBV)toages,types the mostareasofworldthisdisease asoneof most susceptible．In hap