conabp对黄成核与核生长的影响.pdfVIP

摘 要 牛黄是一种珍贵的中药材。为众多著名中成药的重要原料之一。由于 天然牛黄产量极少，人工牛黄药理作用远远不如天然牛黄，因此市场上的 牛黄一直处于供不应求的状态。国内许多研究人员转向人工培植牛黄的研 究，但是主要集中在如何提高其产量而忽视了对牛黄形成机理的研究，这 就导致人工培植牛黄的质和量仍然不能满足市场的需求。本课题组利用电 泳技术、层析技术以及间接免疫荧光的方法研究了胆汁中蛋白质在牛黄形 成过程中的作用。为了进一步研究牛黄形成的机理，本试验利用亲和层析 技术从牛胆汁中提取伴刀豆球蛋白结合蛋白(ConABP)，然后向成核性 牛胆汁(新鲜胆汁过滤消毒后与菌液按体积60：l混合即为成核性牛胆汁) 中添加观察其体外促成核效应：利用间接免疫荧光染色法研究细菌和 过程中的作用。 试验一 耐胆汁大肠杆菌的驯化及胆汁蛋白质电泳分析 本试验首 先用牛胆汁对09血清型大肠杆菌逐步驯化使其能够在胆汁中生长繁殖， 然后对牛新鲜胆汁以及成核性胆汁成核前后的两个阶段进行电泳分析。结 果表明，新鲜牛胆汁中含有六条清晰的蛋白质条带及六条不清晰的条带 清晰的蛋白质条带无明显变化。 试验二 胆汁中ConABP的提取及其成核效应检测 通过亲和层析技术 (ConA Sepharose4B)从牛胆汁中提取ConABP，并对其进行电泳分析， 然后向成核性胆汁中添加不同剂量的ConABP，以观察其促成核效应。结 KDa、 果表明，牛胆汁中ConABP含有三种不同分子量的蛋白质(29．2 26．4KDa和16．0 高峰期的牛黄核的数量(P0．05)以及成核初期和后期最大核的可视表面 积(PO．05)；添加组对成核性胆汁中总蛋白和钙离子含量办有一定的影 响，说明ConABP对牛黄的形成和生长都有促进作用。 试验三 牛黄中大肠杆菌及ConABP的荧光抗体染色检测为了观 测细菌和ConABP是否参与牛黄核的形成以及它们在牛黄中的分布情况， 本试验通过制备牛黄冰冻切片、利用兔抗大肠杆菌和ConABP的多价高免 血清以及FITC标记的羊抗兔IgG荧光抗体对牛黄切片进行免疫荧光染色。 存在于胆红素钙盐颗粒的连接处。 关键词：培植牛黄；电泳；ConABP；亲和层析；间接免疫荧光染色 Abstract bovisiSakindofrare Chinesemedicine．whichiSrare Calculus traditional raw of andalso material famousChinesemedicines． important many patent oflow ofnaturalcalculusborisaswellasmuchweaker Becauseyield of boris withnatural actionartificialcalculus pharmacological compared calculus ofcalculusborishasbeenunabletomeetthe bovis，the supply concentrated demandinthe domesticresearchershadbeen on market．Many calculus