dot-elia检测犬恶丝虫抗体方法的建立及犬恶丝虫可溶性蛋白的抗原性研究.pdfVIP

摘要 犬恶丝虫病是由犬恶丝虫引起的呈世界性分布的寄生虫病，该病严重影响犬猫及 小熊猫、狼、狐等多种野生肉食动物的健康． 感染犬恶丝虫病严重的动物有明显的临床症状，容易确诊。而轻度感染、感染早 期或夏季潜伏期病例却较难发现，因此该病的早期诊断比较困难．目前国内关于犬恶 丝虫病诊断方面的报道主要是病原学诊断，而国外资料报道犬恶丝虫的可检测血清抗 体水平往往比典型的临床症状出现得早，且血清学诊断方法比临床诊断方法有更高的 检出率，因此本研究用提取的可溶性蛋白作为诊断抗原建立了检测犬恶丝虫病血清抗 体的Dot-ELISA方法。诊断抗原是将收集的犬恶丝虫经反复冻融、研磨、离心的方 lI 法获得。通过反复筛选，确定了该法的最佳反应条件：抗原最适包被浓度为16．41 min， g／m1，包被温度和时间为37℃30min，封闭液为1NBSA，封闭条件为37℃50 60 抗原抗体反应条件为37(3 60 min，血清稀释液和洗 度为1：4000，孵育条件为3712min，底物作用时间为20 涤液均为0．01Y pH7．4 片具有良好的特异性：不与犬蠕形螨高免血清、犬钩口线虫高免血清、犬弓首蛔虫血 清等阳性血清反应；膜片具有良好的灵敏性，高免血清作1：28稀释亦能检出；重复 性试验表明该法重复性良好。诊断膜片保存期长，在412保存12个月其检测活性不 变。该方法操作简便快捷，3．5小时内即可完成。结果表明Dot-ELIS^简便、快速、 灵敏、特异，重复性好，结果客观、稳定，肉眼容易判定，不需要特殊仪器，诊断膜 便于寄送、保存，各种试剂和材料都可作到标准化。Dot-ELISA为犬恶丝虫病的诊断 和流行病学调查提供了良好的技术手段。 为了寻找诊断犬恶丝虫病的特异性抗原，本研究应用SDS对提取的犬恶丝 虫可溶性抗原组分进行分析，然后用犬恶丝虫高免血清、自然感染犬恶丝虫血清和阴 性血清进行免疫印迹(Westernblot)。电泳结果表明提取的粗抗原中共分辨出23条 蛋白条带，主要分子量范围在19～120 22和19kDa。免疫印迹结果表明高免血清与自然感染血清能识别许多相同的条带， 但高免血清还能识别其它一些条带。另外，不同的自然感染血清识别的条带也有差异， 最多的可识别10条条带，最少的也能识别8条条带，但都能识别120、70、56、36、 22和19kDa六条蛋白带。 关键词：犬恶丝虫Dot-ELISA抗体免疫印迹 the hnmit缸and oftheCrudeSolubleProteins Dirofdaria Antigenicity DehaoLiu(preventive veterinarymedicine) Directed byProf．GuangyouYang Prof．ChengdongWang diseaseWasa immitiswhichWas Abstract：Heartwormdiseasecaused Dirofilaria by aworldwide an effectonthe of{mimal zoonosis，hadimportant develop