动力学光度法测定体液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶.pdfVIP

数理医药学杂志990126 数理医药学杂志 Journal of Mathematical Medicine 1999年 第1期 No.1 1999 动力学光度法测定体液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 袁亚莉　　邓健　　许金生　　李振玉 　　摘　要　建立了检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的动力学光度分析新方法。 该方法灵敏、操作简便、结果可靠、试剂稳定，可用于各级各类医院对人体血清或尿样 中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的检验。 　　关键词　N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶　动力学光度法　体液 　　N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究结果 表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标 ［1～ 3］，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG活力的测定主要有荧光分光光度 法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜 用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋， 但有的操作麻烦费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。 本文基于NAG催化水解对硝基苯-N-乙酶-β-D-氨基葡萄糖苷生成有色的对硝基酚这一 反应，经反复试验确定了最佳实验条件，建立起简便、快速检测体液中NAG活力的动 力学光度分析法，用于多种病人血清和尿样中NAG活力的测定，均获得满意结果。 1　实验部分 1.1　仪器与试剂 　　723型分光光度计(上海第三分析仪器厂)，电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械厂)。 　　缓冲溶液：用双蒸水配制50mmol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液,pH=4.6±0.05。 　　底物溶液：称取适量对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(相对分子质量342.3)， 用缓冲溶液配成10mmol/L溶液。 　　终止液：0.1mmol/L氢氧化钠溶液。 　　标准溶液：准确称取适量在50℃干燥24h的对硝基酚，用双蒸水配成150μmol/L溶 液。 1.2　实验方法 　　取4支试管编号(分别为空白管、标准管、测定管和对照管)，在空白管中加100μl蒸 馏水，标准管中加入100μl标准溶液，测定管和对照管中各加入100μl血清或尿样，再 在标准管和对照管中各加500μl蒸馏水，在空白管和测定管中各加500μl底物溶液，一 应，用1cm比色池于401nm处以蒸馏水调零测定吸光度，按下式计算NAG的活力： 　　 　　(注：NAG的活力以国际单位表示，即1L样品中NAG在37℃水解底物，每分钟生成 万方数据 file:///E|/qk/slyyxzz/slyy99/slyy9901/990126.htm（第 1／3 页）2010-3-23 7:21:13 数理医药学杂志990126 1μmol/L的对硝基苯酚相当1u/L)。 2　结果与讨论 2.1　吸收光谱 　　在本实验条件下从350～450nm范围内测定标准溶液的吸光度，得知对硝基苯酚最 大吸收波长为401nm。 2.2　催化水解酸度 　　选用不同缓冲对构成的pH缓冲溶液溶解底物，结果表明，当反应液pH在4.50～4.75 范围内，NAG催化底物水解反应效果最佳。本实验先用柠檬酸-柠檬酸三钠组成的pH为 4.60±0.05的缓冲液为催化水解反应介质。 2.3　反应时间 　　将不同待测样品与底物溶液混匀置于37℃水浴中温育，并于不同时间加入终止液终 止反应。结果表明，在20min和40min内，血清和尿样中NAG反应速度恒定。本法选定 血清和尿样中酶催化水解反应时间分别为15min和30min。 2.4　缓冲溶液浓度 　　缓冲溶液浓度明显影响酶促反应速度。以不同浓度的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液 配制底物溶液进行试验，结果表明，缓冲溶液浓度越大，NAG活力受抑制越明显；但 当缓冲溶液浓度低于50mmol/L时，其缓冲能力减弱。 2.5　底物浓度 　　配制不同的底物溶液测定血清和尿样中的NAG活力。当底物浓度低于8mmol/L时， 测定结果随底物浓度的增大而增加，对样品尤其对高酶活性样品的检测结果不太理想； 当底物浓度大于9.6mmol/L，酶促反应加快且吸光度稳定。本法选定底物为10mmo