耻垢分枝杆菌烯酰辅酶A水合酶编码基因表达分析及其敲除质粒的构建.pdfVIP

2015年1月 四川师范大学学报(自然科学版) Jan．．2015 of JoumalSichuanNorrnal V01．38．No．1 第38卷第l期 Universily(NaturalScience) 耻垢分枝杆菌烯酰辅酶A水合酶编码基因 表达分析及其敲除质粒的构建 任尧， 程世君， 马彩虹， 王薇伊， 唐 明， 李 维， 葛方兰， 陈贵英+ (四川师范大学生命科学学院，四川成都610101) 摘要：胆固醇是某些病原菌胞内生存所必需的碳源和能源物质，而胆固醇的各种代谢酶是潜在的药物 作用靶点．烯酰辅酶A水合酶主要参与了脂肪酸的B一氧化循环，但其在胆固醇降解中的作用机理尚不完 全清楚．首先对耻垢分枝杆菌(肘yc06∞抛“ums，r嘲mn￡厶Mc2155)进行了全基因组有哪些信誉好的足球投注网站，获得了18个烯酰辅 酶A水合酶的候选基因．对在不同甾醇类化合物条件下的转录组测序结果进行了分析，发现18个候选基因 差异表达明显，其中位于胆固醇降解基因簇中的Ms肘EG一5915(ec^A19)，在胆固醇条件下表达明显上调， 枝杆菌进行了基因转化．经PCR快速分子鉴定，邶MEG_5915基因被同源整合于耻垢分枝杆菌染色体上． 为进一步揭示榔艇G_5915(ec^A19)基因的功能奠定了基础． 关键词：耻垢分枝杆菌；烯酰辅酶A水合酶；转录分析；敲除质粒；电转化 中图分类号：Q933 文献标志码：A 文章编号：1001—8395(2015)01—0126—08 doi：10．3969／j．issn．1∞l一8395．2015．01．02l 自20世纪50年代以来，甾醇类化合物的微生 固醇侧链切除的研究报道也较少，一般认为微生物 物分解代谢引起了学者们的极大关注．一方面，甾 是通过类似脂肪酸B一氧化途径对胆固醇侧链进 醇类化合物通过微生物转化后，可以产生许多甾体 行切除‘2。3’6I． 药物的重要中间体¨。1；另一方面，胆固醇是结核 烯酰辅酶A水合酶(enoyl—CoAhydratase， 分枝杆菌等病原菌胞内生存所必需的碳源和能源 echA)具有功能多样性．它不仅参与脂肪酸的B一 物质HJ，而参与胆固醇代谢过程的各种酶是潜在的 氧化，还参与异亮氨酸、结氨酸的降解，以及B一丙 药物作用靶点‘5‘6o．因此，有必要对胆固醇的微生 氨酸、色氨酸的代谢¨1|．脂肪酸B一氧化可分为脱 物降解途径和机理开展深人而系统的研究．甾醇类 氢、水合、再脱氢和硫解4个步骤，其中水合是在烯 化合物微生物降解的模式菌株主要包括结核分枝 酰辅酶A水合酶催化作用下，反式一△2一烯酰一 杆菌(肘yc060c抛一“m￡u6erc“‰始)、耻垢分枝杆菌 MC2 基于胆固醇降解菌一耻垢分枝杆菌转录组测序的 (M．s，，记譬mofis155)、红球菌RHAl(尺^o如coc— c榔sp．strainRHAl)，而它们基因组中均存在着多基础上，对存在于耻垢分枝杆菌基因组中所有烯酰 个同源性较高的胆固醇降解基因簇．胆固醇的微生 辅酶A水合酶候选基因的表达水平进行分析，得到 物降解包括细胞吸收、侧链切除、开环3个主要环 参与胆固醇降解且表达水平明显上调的烯酰辅酶 节【2．7]．在生物化学水平上，研究者们通过对多种中 A水合酶基因椰伽G-5915．本研究对其编码基因 间产物的鉴定，推测出了胆固醇微生物降解过程的 进行了基因克隆、敲除质粒的构建以及遗传转化， 大致轮廓口’6—7|．但在分子水平上，目前仅鉴定了数 为进一步确定其基因功能，阐明胆固醇B一