利用egfp基因对中华蜜蜂卵进行显微注射的初步研究.pdfVIP

维普资讯 l0 试验研究报告 中国蜂业 APICULTURE 0F CHINA 2008年 第59卷 第 7期 文【章标号10412．-4367(2008)07—0010—02 利用egfp基因对中华蜜蜂卵进行显微注射的初步研究 郭冬生 孙亮先 陈碧强 (1．宜春学院生命科学与资源环境学院，江西 宜春 336000； 2．泉州师范学院模式生物研究中心，福建 泉州 362000) 摘 要：利用显微注射法对中华蜜蜂0～12h卵注射绿色荧光蛋白基因，注射后的卵采取人工繁殖和蜂 群 自然培养两种方式饲养，结果蜜蜂卵注射后存活率低，绿色荧光蛋白基因表达不理想；实验探讨了中华蜜 蜂卵显微注射转基因技术，为今后蜜蜂显微注射转基因研究和改进提供了一定参考价值。 关键词：中华蜜蜂；显微注射；绿色荧光蛋 白基因 中【图分类号1S891．3 文【献标识码】A 蜜蜂不仅是社会性昆虫遗传研究的一种模式生 1．1试剂与主要仪器 物，而且在重要基础科学研究方面，如理解认知能 质粒pEGFP—N1和DH5e~，由泉州师范学院模 力、复杂社会行为、级型分化、性决定的单二倍体模 式生物研究中心保存；矿物油AMRESCOMineraloil 式等遗传研究上具有重要意义…。蜜蜂在显微注射 (1ight，white)；ApalI限制性核酸内切酶购于公司；质 DNA基因转移研究方面具有许多优势。蜂卵大小是 粒小量提取试剂盒购于上海中科开瑞生物芯片公司 果蝇卵的14倍。蜂王一天可产 1500多个卵，大量蜜 CASpurePlasmidIsolationKit；PlatinumTaqDNA聚 蜂卵很容易获得；蜜蜂受精卵体外发育，卵后端卵膜 合酶购 自invitrogen公司。 半透明、松软，易于操作。蜜蜂卵的卵膜没有家蚕、果 Zeiss倒置显微镜 (德国蔡司公司产品)；eppen— 蝇卵壳硬，较薄，卵膜厚度约0．1-0．251xm(家蚕卵壳 doff显微操作系统 、SterileFemtotips注射针 2O根 171xm)，易于玻璃针穿过注射，无需去卵壳就能用注 (德国Eppendorf公司)；PCR仪 、离心机、生化培养 射针将DNA注入卵内。蜜蜂卵大约需要 lOh形成细 箱、Millipore纯水系统、超净工作台、Axiovert40型 胞胚囊 ，果蝇只要 2h，时间长也有利于选择合适注 倒置荧光显微镜仪、佳能PowerShotG6数码相机、 射卵样品 。 取卵器、高压蒸汽灭菌器、电泳仪和凝胶成像系统、 最早 ，DuPraw(1967)~0用直径 401~m针注射蜜 电子分析天平、核酸测定仪等。 蜂卵的顶端，进行了基因移植实验。他在报道中指出 1．2方法 中期卵注射后也能孵化幼虫，但早期卵更有利于 1．2．1质粒提取与线性化 DNA整合到细胞核中3]【。Milne等 ]【(1988)研究了意大 pEGFP—N1转化大肠杆菌 DH5e~，卡那霉素 利蜜蜂卵显微注射，用矿物油注射刚产下的卵，结果 f501xg／mL)筛选阳性菌落，LB培养基扩大培养，用试 注射的卵有21％的孵化率。邵瑞宜等 【](1998)用石蜡 剂盒CASpurePlasmidIsolationKit提取质粒，方法 油通过显微注射技术对 1日龄中华蜜蜂卵注射，平 按试剂盒说明书进行，提取的pEGFP—N1质粒进一 均孵化率达 35．13％。挪威农业大学 Bergem等 步纯化。所得质粒 OD(A260／A280)为 1．845，用 A— (2006)】先后利用显微注射生产了嵌合体蜜蜂幼虫。 palI37oC进行单酶切