肝癌相关标志物高尔基体蛋白GP73的基因克隆、表达、抗体制备及初步应用.pdfVIP

后DNA阴转的几率降低了56％。)。 结论LHBs能够反映了HBeAg阴性乙肝患者病毒复制的水平，是HBVM检测的有益的补充； DNA下降的趋势一致，但是晚于HBVDNA的消减：抗病毒治疗过 抗病毒治疗过程中LHBs和HBV 对抗病毒治疗监测具有重要临床意义。 关键词 乙型肝炎病毒大蛋白：抗病毒治疗；HBeAg阴性乙肝 肝癌相关标志物高尔基体蛋白GP73的 基因克隆、表达、抗体制备及初步应用 解放军第三O二医院临检中心100039 李伯安林长青马洪滨徐军郭静霞毛远丽 要原因。作为一种高死亡的疾病，HCC的诊断研究对早发现，早治疗，延长患者生存期具有非常重 要的意义。目前HCC的肿瘤标记物只有AFP应用的最广泛，其灵敏度为39％70％左右。此外在 慢性肝炎及肝硬化等良性病例中也有一定的阳性率。因此我们需要进一步寻找诊断HCC的既敏感又 特异的早期生物标记，从而及时治疗及预后监测。高尔基体蛋白GP73是一种新发现肝癌早期诊断 GP73蛋白含量明显升高，GP73可能成为HCC早期诊断重要血清学诊断指标，但迄今为止，方法都 采用免疫印迹半定量检测，缺乏相关高通量方法进行临床应用。 材料与方法 菌种、细胞株为我院保存。 二、GP73基因序列的克隆、序列测定、表达及纯化：血清DNA的提取、PCR扩增按常规方法 进行。PCR产物经纯化后，分别用BamHI、Sal I进行消化，同时消化质粒pET-28。将纯化后的线性 备大肠杆菌BL21感受态细胞，加入经连接反应后的混合物，以热休克法转化质粒DNA进入感受态 HI和 组克隆，扩大培养后，采用质粒小量提取Kit提取质粒进行核苷酸序列测定，并分别应用Bam Sal 菌液离心，回收茵体沉淀，以50皿凝胶加样缓冲液悬浮，煮沸5rain，离心后取20止上清进行 ·294· 格按试剂盘说明书进行操作。重组质粒pET-28．GP73利用通用引物进行双向测序，序列测定由华大 基因完成。 三、多克睦抗体的制备、纯化、标记：接常规标准方j去，将上述获得的GP73纯化蛋白免疫新 酸钠法，用辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化的多抗。 四、单克隆抗体的制备：按常规标准方弦，将上述获得的GP73纯化蛋白免疫Bablc小鼠．常规 PEG法制备杂交瘤细胞，经筛选获得1株特异性较好、抗体滴度较高的单抗细胞株；饱和硫酸铵法 纯化单抗。 五、双抗体夹心ELISA检测方法的建立：用包被渡(50mmol／LPH96碳酸盐缓冲液)稀释单克 终止反应，测450删的吸光度A值。在上述的基础上按系列倍比稀释的方{去进行矩阵实验．确定 ELISA实验中的最佳包键、血清稀释度亚酶标抗体旅度确立ELISA检测方案， 六、不同人群血清检测GP73的初步应用研究：我们对50倒健康献血员，296例慢性肝炎患者 阴性)进行6十月的随访跟踪，对结果进行统计分析。 结果 一、重组质粒的鉴定及序列测定：重组质粒进行序列测定与报道的GP73基因序列对比，ORF 中1212个核苷酸同源性为100％。阳性重组质粒经酶切后，可见一条1212bp左右的酶切带与预期结 果一致，再次证明该插入片段的正确。 二、重组蛋白的诱导表选、纯化：菌体经诱导、表达、裂解后进行SDS电濂。核苷酸序 列输入计算机后．经DNA 泳，仅见判一条略小于原始袭选带的电泳带，证明纯化成功。 三、多抗、单抗制备纯化：获得多抗血清约50ml，获得单抗杂交瘤细胞株4株。 圈1 GP73单抗对GP73基因重组蛋白的蛋白印迹 图3肝癌组织GP73多抗染色 囤4肝癌组织与癌旁组织染色对比 四、顾抗体夹心ELISA检测方法的建立：初步ELISA法实验表明5例肝 36～2 癌患者血清OD值为O 99，证明建立血清了双抗体夹心ELISA检测GP73的方j去．并证 实单抗、多抗有共同的抗原结合伍点。随后根据矩阵实验结果确定单抗工作浓度均为S