反义ATP合成酶亚单位e抑制人肝癌细胞BLL-7404生长.pdfVIP

反艾ATP台成酶亚单位c抑制人肝癌细胞BLL一7404的生长 229 应浩徐永华 癌症可以被看作是一种基因疾病，在单个细胞中，各种形式的破坏导致多种形式的遗传学 改变，这些改变经过遗传与积累就产生了许多基因的变异”“j。现在癌症研究所面临的挑战 之一就是在众多的基因中找出与癌症相关的基因。肝癌是全球性的常见癌症之一”41，我们实 验室是通过差异显示的方法”1来寻找在肝和肝癌中表达差异基因的。 作为ATP合成的催化位点。Fo复合物跨越线粒体内膜，是个质子通道。现在已经发现的F1 复合物亚单位有n、B、7、8和E，它们大多数在原核和真核生物中高度保守”’1，然而m复合物 的组成变化就相对比较大。hAS—e作为FD复合物的亚单位之一，其功能至今还不太清 楚‘Jo-r2]。 在癌发生过程中，许多信号转导途径起了重要作用。其中MAP激酶信号转导途径是一个 将信号从生长因子受体传达到细胞核，并引起细胞增殖的信号通路”“。由于许多癌基因编码 了处于这条通路上游的蛋白，并将促进细胞分裂的信号发送下去，因此MAP激酶途径的激活 可以用来解释大多数非核癌基因的作用机制““”J。 ， 我们通过对1倒正常肝组织和4例肝癌组织进行了差异显示分析，分离到了线粒体 清刺激时，MAP激酶的激活受到了抑制。 材料与方法 (一)材料 肝癌组织和癌旁正常组织都通过了病理检测。 (二)全长hAS—eeDNA的克隆 差异显示方法按文献”1进行操作。目的条带割下后被再次扩增，并进行平端连接和转化。 定其序列的正确性。 中国科学院人类基因组研究项目，国家重大基础研究特别基金(G1999053905)资助 作者单位：200081上海．中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国癌症研究进展@ (三)RNA抽提和Northernblot分析 XL (Plmrmacia)上，然后用80℃烘烤固定2h。探针来自购买的EST克隆，并用随机引物标记试剂 条带分别用FUJIFILMImageReadernA一3000(V1．0)和Image Gauge(V3．12)进行扫描和定量。 (四)反义表达载体的构建和转染 包含l遗s—e全长oRF的eDNA片断从EST克隆中扩增出来。上游引物包含BamHi酶切 位点：5’一TATC,GATCcA代僦CAcCGGl_{G一3’，下游引物包含EcoRI酶切位点：5’一TAT- Q帆cG(mzl℃c|I℃cAAA一3’。扩增产物经BImHI和EcoR I双酶切后连接到pBlu∞西pt I和EcoRI ⅡsK+(Stratagene)载体上。经测序确定序列无误之后，将该eDNA片断用BamH 切下后亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1(一)／Myc—His 7404接种于100 n¨培养皿中，每个培养皿接2×10个细胞。用硫酸钙沉淀的方法转染30帖 d后，有C,418抗 表达质粒，24h后以1：10的比例传代，并用含400硝柚CA|8的培液筛选。14 性的细胞克隆被分离出来。 (五)MTr分析 细胞以每个孔1000个的密度接种于96孔板。将25m的Ma r(Sigma)储存液15mg／nd)加 入孔中，370c温浴2 h后加入100脚抽提液，然后再置于37C温浴过夜，最后用分光光度计以 抽提液为空对照测量570m的光吸收““。