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124中国棉花学会2011年年会论文汇编 棉花总DNA快速提取技术及其在国家棉花区试中的应用 付小琼。杨付新。刘逢举．王秀玲 (中国农业科学院棉花研究所／棉花生物学国家重点实验室／ 农业部棉花遗传改良重点实验室，河南安阳455000) A Extraction ofCottonDNAandIts onRe。 Rapid Technology Application Cotton gional VarietiesTests FU Fu—xin，LIU Xiao-qiong，YANGFeng—ju，WANGXiu—ling 随着生物技术突飞猛进的发展，多种分子标记被应用于农作物品种的真实性和纯度的鉴定，尤其 是SSR分子标记，操作简单，重复性好，大多数标记表现为共显性，对DNA质量要求不严格，被应用 得更为广泛。品种的纯度鉴定工作量很大，样本数量多，时间紧迫，DNA提取的速度和质量至关重 要采用子叶和种子快速提取DNA，速度提高，DNA质量保证，PCR扩增条带清晰。 l 材料与方法 1．1材料 供试材料：2011年长江流域棉花区域试验参试品种的种子和在生长箱中发芽～周的子叶。 MM400 试验设备：Retsch 混合型研磨仪、BECKMANDU800紫外分光光度计、SIGMA高速 冷冻离心机、BIO-RADPCR扩增仪、DYY一6C电泳仪等。 试验试剂：所用试剂均为分析纯，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、硼酸、CTAB、pvp40等主要试剂从 上海生工生物有限公司购买，氯仿、无水乙醇、异丙醇、硝酸银等试剂由北京化工厂生产，10×Buffer、 DNA Taq 物有限公司合成。 1．2方法 1．2．1子升DNA提取技术。在前人常用的DNA提取法(两次抽提法)的基础上，制定了子叶快速 提取的技术，简称一次抽提法。 子叶的快速提取方法主要步骤如下： 1)取发芽l周的子叶一片装于2mL的离心管中，同时装入一粒钢珠，保存于一70℃低温冰箱中备 s。 用。提取时用研磨仪进行冷冻研磨，一般磨2次，每次20 2)研磨后取出钢珠，加入提取液700肚L，摇匀，放入65℃水浴40rain，中间每10min缓慢颠倒离 心管。提取液的组成：0．1tool·L-1Tris—HCI、0．025tool·L。1EDTA钠盐、2 oACTAB、2％pvp、1．5 tool·L1NaCl、2％巯基乙醇。 3)加入等体积的氯仿t异戊醇(24：1)，缓慢颠倒8～10min，4℃条件下12000r·rainl离心10min。 4)取上清液，加入0．6倍的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结，静止2rain，用 移液器枪头把絮状物挑到离心管中。 菌超纯水溶解DNA，保存于-20℃冰箱中备用。 与前人的方法相比[1矗]，技术的改进主要有以下几点： 1)子叶放人带钢珠的2mL的离心管中，在液氮下冷冻后用自动研磨机磨样品，速度提高，所用 人员减少，省去了手工磨样时倒管一步，样品不易被氧化，保证了提取样品的洁自。 2)用氯仿：异戊醇(24：1)只抽提1次，节省了时间，达到快速的效果，且节省了试剂和耗材。 3)氯仿抽提过程中缓慢颠倒时间延长至8～10rain，一次抽提尽可能多地去除蛋白质。 1 2．2种子DNA提取技术。CTAB法提取种子DNA牛蛰步撵如下： 1)用电动种子粉碎机将去壳棉仁亢分粉碎后转^?ml的离一。符o o 2)加入提取液700吐，摇匀，故人6jt水浴I(-rain中刚铒im¨l缓慢新倒离■骨摊墩被蚋 I ED mol·L1TrB mol·I．1 1， 组成-0 HCI、：