大肠杆菌T蛋白PDH结构域的高效表达纯化与活性测定.pdfVIP

　　 大肠杆菌 T 蛋白 PDH 结构域的高效表达纯化与活性测定 陈静 ,阮昊 ,水文波 ,陈枢青 (浙江大学药学院生物制药研究室 ,浙江 杭州 310031) ( ) 摘要 : 目的　构建高效表达菌株 , 以大量表达大肠杆菌 T 蛋白的预苯酸脱氢酶 PDH ,为研究 T 蛋白双功能结构域 CM 和 PDH 的相互协同作用以及 T 蛋白抑制剂对其影响提供活性蛋白材料。方法 　利用 pGEX 高效融合表达系统将 PDH 与谷光甘肽疏 ( ) 基转移酶 GST 编码序列在表达宿主BL21 实现高效表达 ,并利用对 GST 具有亲和作用的 Glutathione Sepharose 4B 琼脂糖珠进行 亲和层析以对其分离纯化。结果 　表达产物达菌体总蛋白的 40 % ,可溶性目的产物得量为 240 mg ·L - 1 ,利用亲和层析法纯化 后纯度达 92. 5 % ,GSTPDH 融合蛋白的 PDH 的比活为38 U ·mg - 1 。结论 　本法成功构建高效表达 PDH 菌株 ,表达量高 ,纯化 度高 ,GSTPDH 酶活性正常 ,为进一步研究奠定基础。 关键词 :T 蛋白 ;预苯酸脱氢酶 ;谷光甘肽巯基转移酶融合表达 ;酶活性 ( ) 中图分类号:Q812 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :1001 - 2494 2005 03 - 0224 - 04 High expression , purification and bioactivity of prephenate dehydrogenase domain in E coli Tprotein CHEN Jing ,RUAN Hao ,SHUI Wenbo ,CHEN Shuqing ( Department of Biopharmaceutics , College of Pharmaceutical Sciences , ) Zhejiang University , Hangzhou 310031 , China ( ) ABSTRACT :OBJECTIVE　To clone and highly express prephenate dehydrogenase PDH domain in E. coli Tprotein for the further study of synrgistic action with chorismate mutase domain. METHODS 　The pGEX4T1 vector was employed for the high expression of prephenate dehydrogenase domain. The Nterminal GST tagged fusion protein was purified by Glutathione Sepharose 4B. RESULTS 　High expression of ( β ) soluble target protein was obtained by IPTG isoprogyl Dthiogalactoside , which accounted for approximately 40 % of germ proteins. The fu sion protein was obtained with the pu