Rabex-5基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其在MCF-7中对Rabex-5表达的影响.pdfVIP

一 34一 重庆医科大学学报 2012年第37卷第 1期 (JournalofChongqingMedicalUniversity2012．Vo1．37No．1】 DOh10．39696．issn．0253-3626．2012．01．011 Rabex一5基因RNAi慢病毒表达载体的构建 及其在MCF-7中对Rabex-5表达的影响 闵 捷，厉红元，潘 雪，李 焰，王颖建，张 翔，梁欣洁 (重庆医科大学附属第一医院内分泌乳腺外科，重庆 400016) 【摘 要】目的：构建Rabex一5RNAi慢病毒表达载体，并转染人乳腺癌细胞株MCF一7，观察其对Rabex一5基因的沉默效应。方 法：将设计合成的单链引物退火成双链oligo序列，连接入经AgeI和EcoRI双酶切线性化的pMAGic慢病毒质粒载体中，经转 化 DH5et感受态细胞并筛选出阳性克隆，测序鉴定。用293F~细胞包装产生慢病毒 ，感染MCF一7细胞，利用 Real—timePCR和 Westernblot鉴定抑制Rabex一5表达的效果。结果：PCR与测序鉴定证实成功构建了Rabex一5RNAi的慢病毒载体，转染MCF一7细 胞后，与未干扰组和阴性对照组相比，Rabex一5的mRNA和蛋白表达下调，以RNAi3的沉默效应最佳。结论 ：成功构建了Rabex一 5RNAi慢病毒表达载体 ，其可使MCF一7细胞株Rabex一5表达下调，为进一步研究靶向Rabex一5RNAi对乳腺癌细胞恶性生物 学行为变化及基因治疗研究奠定了实验基础。 【关键词 】Rabex一5；RNA干扰；慢病毒载体；人乳腺癌细胞株MCF一7 【中国图书分类法分类号】R737．9 【文献标志码】A 【收稿 日期】2011-12—09 ConstructionofalentiviraIvectorforshRNAOfRabex-5geneandltseffect OnRabex-5expressionjnMCF-7 MINJie，LIHongyuan，PANXue，LIYan，WANGYin~ian，zHANGXiang，LIANGx呐te (DepartmentofEndorcrineSurgery，theFirstAffiliatedHospital，ChongqingMedicalUniversity) A【bstract]Objective：ToconstructalentiviralvectorforRNAinterference(RNAi)ofRabex一5geneandtodetectitssilenceeffecton Rabex一5inMCF一7cells．Methods：Thesynthesisedsingle—srtandedprimerwasannealed todouble—strandedoligosequencesand sub—clonedintolinearpMAGiclentiviralplasmidvectordigestedbyenzymeAge Iand oRI．DH5a competentcellsweretrans— formedandpositiveclonewerescreened，identifiedandsequenced．Therecombinantlentivirnswaspackagedintomaturelentivirusbv 293FIceHsand usedtoinfectMCF一7 cells．Th eexpressionofRabex一5 inthecellswasdetectedbyreal—timePCR and West— ern blot．Results：PCR andsequencingverifiedthattherecombinantlentivirusplasmidRabex5一shRNA wassuccessfullyconstrncted