凉水、丰林国家自然保护区红松遗传多样性的ISSR分析.pdfVIP

维普资讯 第 23卷 第 2期 沈阳师范大学学报(自然科学版) Vo1．23N0．2 2005年 4月 jo“rnalofShenyangNormalUniversity(NaturalScience) Apr．2005 文章编号：1008—374X(2005)02—0204—03 凉水、丰林国家 自然保护区红松遗传 多样性的ISSR分析 吴隆坤，李 岩 (辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁 大连 116029) 摘 要 ：采用了ISSR分子标记技术对凉水和丰林地区的两个红松种群的74个个体进行了遗传多样性 分析．13个随机引物共检测到 103个可重复的位点，其中82个具有多态性。多态位点百分比分别为73．79％和 71．84％．Shahn0n信息指数和Nei指数的统计结果都表明，红松的遗传多样性凉水种群大于丰林种群，红松种 内的遗传变异主要存在于群体内，种群内存在一定的遗传分化． 关 键 词 ：红松；遗传多样性；ISSR；遗传分化 中图分类号 ：Q948 文献标识码 ：A 红松(p／n“skoraiensisSiebetZucc)针阔混交林是我国东北山地的地带性顶级植被类型，在中国分布于长白山、张广 岭、完达山和小兴安岭的低山和中山地带，蕴藏着丰富的野生动植物资源，树干通直，材质优 良，是珍贵的用材树种、国家 的宝贵财富． ISSR标记是zietkie、^rica等 l【】提出的一种DNA分子标记技术 ，它具有 RAPD技术的优点，又可克服 SSR和RAPD的 某些缺点．TSumura等(1996)’【】用 ISSR技术研究了冷杉(Pseudostugamenziesii)和柳杉(Cryptomeriajaponica)的遗传多样 性 ．钱韦等 (2000)[31采用 ISSR技术研究了疣粒野生稻(0ryzagranulata)的居群遗传结构．Cato等 1996在松科植物Pinus radiata发展cpDNA的微卫星标记对于分析通过花粉传播的基因流，考证物种起源很有价值 引【．对红松遗传多样性的 IS— SR研究有，冯富娟等 【l对长自山不同海拔条件下红松的遗传分化，本研究用 ISSR标记技术对分布于中国东北境内的2 个红松天然群体凉水、丰林的遗传多样性、群体 内和群体间的遗传变异进行了研究，为合理地保护、利用与开发红松遗传 资源提供可靠的科学依据 ． 1 实验材料和方法 I．I 实验材料 ． 所有样本所有样 品均于2002年 6月采 自红松在中国境内的典型分布 区，分别为黑龙江凉水 自然保护 区、丰林的天 然红松林 ．采样时分单株随机取当年生幼叶，两个群体样本数分别为4O和 34个 ． I．2 实验方法 1．2．1 DNA的提取：红松样品采用张恒庆等的方法 【】提取总DNA．DNA溶于0．1XTE缓冲液，琼脂糖凝胶 电泳后，用 美国冷泉港P41G型凝胶成像系统照相，采用GelPro32软件对 比样品条带与DL2000分子量标准的含量确定DNA浓 度，用于PCR反应的模板用双蒸水稀释至 30ng／gL． 1．2．2 ISSR反应体系的建立：总体积 2O L，包括 20ng基因组 DNA，0．2gM 随机引物，187．5t~mol／LdNTP混合物， 0．5UTaqDNA聚合酶。1．5mmol／LMgCIz．(购于TaKaRa)． 引物筛选：ISSR引物为大连宝生物公司合成，溶解时浓度定20 M，做为 10X母液，PCR时稀释成 1M，经预备试 验选择扩增产物稳定、重复性好的引物进行 ISSR扩增 ．共筛选出 13个引物(见表 1)． 1．2．3 ISSR扩增反应程序为 ：反应程序为 ：94℃预变性 5rain；35次热循环，条件为94℃、45s。5O～55℃(不同引物退 火温度不同见表 2)、30s。72℃、2min；最后在 72℃下延伸 7min．反应在Px2热循环仪 (