3.1重组DNA技术的基本工具.pptxVIP

第1节重组DNA技术的基本工具

“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”重组DNA技术的基本工具剪接运准确切割DNA分子将DNA片段连接起来将体外重组好的DNA分子导入受体细胞

一、限制性内切核酸酶（简称限制酶）——“分子手术刀”主要是原核生物来源种类数千种限制酶不是一种酶，而是一类酶作用特点（1）识别双链DNA分子特定核苷酸序列（2）使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。识别序列长度大多数为6个核苷酸，少数为4~8个或其他数量的核苷酸。酶的专一性TGCCGTAA5353

401“分子手术刀”----限制性内切核酸酶拓展：限制酶的名字的由来P72EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichiacoli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）中分离出的第一个限制酶。EcoRⅠ种加词头两个字母菌株型号数字表示分离出来的第几种限制酶属名首字母

GAATTCCTTAAG5’3’3’5’中心轴线GCTTAAAATTCG中心轴线两侧切开黏性末端EcoRⅠ5.作用结果：产生DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式。（1）EcoRⅠ限制酶能特异性识别序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线两侧，切割和之间的，切割后产生。GAATTCGA磷酸二酯键黏性末端

BamHⅠ；EcoRⅠ；HindⅢ；BglⅡ。【练习】：写出下列限制酶切割形成的黏性末端GATCAATTAGCTGATC思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？同种限制酶切割的黏性末端一定相同,不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。

CCCGGGGGGCCC5’3’3’5’中心轴线CCCGGGGGGCCC中心轴线处切开平末端SmaⅠ6.作用结果：产生DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种形式。（2）SmaI限制酶能特异性识别序列（5’→3’方向），在识别序列的中心轴线处，切割和之间的，切割后产生。CCCGGGCG磷酸二酯键平末端

在切割位点，DNA一条链正向读的碱基序列与另一条链反向读的碱基序列完全一致，且在中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的（回文序列）。注意（1）：限制酶识别序列的特点EcoRⅠ……G-A-A-T-T-C…………C-T-T-A-A-G……HindⅢ……A-A-G-C-T-T…………T-T-C-G-A-A……BamHⅠ……G-G-A-T-C-C…………C-C-T-A-G-G……TaqⅠ………T-C-G-A………………A-G-C-T………6.注意

注意（2）：在切割含目的基因的DNA分子时，需要在目的基因的两端都用限制性核酸内切酶切割（需切两处），会产生4个末端。……CTACGATGAATTCCGTAGAATTCCCTAA…………GATGCTACTTAAGGCATCTTAAGGGATT…………CTACGATG……GATGCTACTTAAAATTCCCTAA……GGGATT……AATTCCGTAGGGCATCTTAA黏性末端目的基因

—GAATTC——CTTAAG—注意（3）：判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生①一看裸露碱基是否相互配对；②二看切割位点是否相同。①—A—TGATC④CTAGA—T—②CTAGT—A—③—T—AGATC—A—TGATCCTAGA—T—①②③④②③/①④

注意（4）：P71?限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、起防御作用，以防止外来病原物的侵害，保证自身的安全。注意（5）：P74拓展应用1限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

用同种限