第七章蛋白质或多肽的放射性标记及分析方法.pptVIP

体内标记法的特点：标记蛋白质的性质不会有任何改变，能同时标记多个器官或多种组织的蛋白质。在研究整体代谢方面，体内标记是不可缺少的。但它的应用有其局限性，这是因为：①标记前体或化合物通过道谢通路参加蛋白质，由于代谢库的稀释作用，供细胞合成蛋白质所用的标记前体或化合物的比放射性降低，并且难以测定；②代谢库本身有随代谢速率而变，故难以估计；③放射性物质用量大，既造成浪费又易造成污染。（2）体外标记法（invitro）体外标记法主要是借助细胞培养技术，把标记前体或化合物加入到培养液中，细胞通过生物合成而完成标记的方式。一般多用氨基酸或有机离子作为标记物，故他们很容易穿古过细胞膜。与体内标记相比，体外标记的最大优点是可以精确控制温度、pH、离子强度等环境因素。同时，可对不同组织或器官以及不同生长时期的细胞进行标记。第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日二、标记蛋白(多肽)的分离技术不论采用前述中的任何标记方法，得到的产物均是各种物质的混合物，因此需要进行分离和纯化。根据被分离物质的分子量，电荷等物理性质及状态的不同，可采用吸附与分配层析、离子交换层析、凝胶层析、素和层析、电泳、超速离心、色谱等技术进行分离。下面着重介绍以125I标记胰岛素时，所得各种混合物的分离技术。用125I标记胰岛素时，混合物主要包括：1、未标记胰岛素；2、四种单碘标记胰岛素；3、双碘及双取代胰岛素；4、损伤而未被标记的胰岛素；5、损伤的标记胰岛素；6、游离的无机盐离子，如125I-；7、其他（如氧化剂或酶及其降解产物等）。分离纯化常用的方法主要有：第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日1、分子筛法单碘胰岛素分子中的Tyr酚环羟基邻位上的氢原子被一个碘原子置换后，酚羟基的pK值从10.1下降到8.6，被两个碘原子置换，pK值降至6.8。在pH8.6时，原型胰岛素所带的净电荷为单碘胰岛素的一半，pH为6.8时，则差别更大。根据在相同pH时，碘化胰岛素所带静电荷不同于原型胰岛素的原理，有人用离子交换层析，或聚丙烯酰胺凝胶电泳法将标记胰岛素和未标记胰岛素分开。2、离子交换法用DEAE-SephadexA25，AE纤维素，AmberliteIRA-400阴离子交换树脂，采用梯度洗脱或改变洗脱液离子强度或pH等方法，可将未标记胰岛素、标记胰岛素（包括单碘、双碘胰岛素）、双取代或双碘胰岛素逐一洗脱下来。但是此法并不能分离碘化位置不同的单碘胰岛素。第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日3、聚丙烯酰胺凝胶电泳法此法首先于1959年由Omstein和Darris报道。由于其操作简便，仪器简单，分辨率高，而被广泛应用于生物化学及分子生物学研究。1974年被用于碘化胰岛素的分离，此后不断得到改进。此法能将标记胰岛素与未标记胰岛素，损伤碎片及游离125I-等无机盐分开，还可将单碘A14和A19，双碘胰岛素等分开。聚丙烯酰胺是由95%的丙烯酰胺和5%双甲叉丙烯酰胺经过硫酸铵活化聚合而成。电泳过程中，由于电荷效应和分子筛效应的差别，Rf值不同，使标记混合物中各种成分能得到分离，A14和A19单碘胰岛素虽然都标记一个125I-，但亦能被分开；确切机理尚不清楚。B16和B26单碘胰岛素与A19标记物Rf值相同，不能分开。无机盐（包括125I-），在此系统中泳动最快，在指示染料带之前，能满意除去。由此得到的A14和A19单碘胰岛素质架期可达6个月。其他如等电聚焦法亦可获得较纯的A14和A19单碘标记物，但方法较复杂，仪器和试剂要求教高，不尽实用。第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日三、32P标记分子杂交实验证明遗传信息从DNA到mRNA的转录Spiegelman利用人工合成RNA-DNA杂种分子的实验证明RNA分子的核苷酸顺序由DNA转录决定，RNA分子的生物信息来自DNA。把双链DNA加热，使产生单链DNA分子，若在热溶液逐渐冷却过程中加入与该DNA链互补的单链mRNA，则在形成复性DNA分子的同时会有DNA-RNA杂种分子形成。形成杂种分子的条件是这种RNA分子的核苷酸顺序与DNA分子中某些核苷酸顺序互补。利用这个原理，可以鉴别RNA与DNA碱基顺序是否有互补的特性。实验也可采用放射性标记技术进行。将T4噬菌体感染的大肠杆菌(E．Coli)放在含32PO43－的培养基中培养，提取32P标记的RNA，将32P-RNA分别加到E．Col