桑叶生物碱的提取纯化及其W_O_W双重纳米乳的制备.pdfVIP

摘要

桑叶（MoriFolium）为桑科植物桑（MorusalbaL.）的干燥叶，《神农本草经》认

为其能“主消渴”（即现代糖尿病），《本草纲目》亦谓其“汁煎代茗，能止消渴”，

《本草图经》云“桑叶可常服，神仙服食方……名神仙叶”，因此桑叶在开发辅助降血

糖保健产品方面很有潜力。现代研究表明桑叶中降血糖的主要成分为桑叶生物碱（特征

成分为1-脱氧野尻霉素，1-DNJ），是一类具有多羟基哌啶结构的天然α-葡萄糖苷酶抑

制剂，可用于糖尿病的防治。口服桑叶生物碱存在半衰期短、生物利用度低的问题，可

考虑制成恰当的缓控释制剂来解决。“W/O/W双重纳米乳”在提高生物利用度方面有一

定优势，可通过内水相（W）、油相（O）及外水相（W）的“两膜三相”结构将亲水

12

性药物包埋于内水相中，利用外层的油相和外水相保护内水相，从而实现活性物质的缓

释。本研究拟采用W/O/W双重纳米乳包埋桑叶生物碱，以期能够延长其在体内的半衰

期，提高桑叶生物碱的口服生物利用度。主要研究内容如下：

1.桑叶生物碱分析方法的研究。（1）桑叶生物碱的定性分析。采用薄层色谱法对

桑叶生物碱进行定性分析，展开条件为正丁醇-冰醋酸-水（5:3:1），显色剂为氯-邻联甲

苯胺溶液和2%的茚三酮溶液，比较两种显色剂，结果表明氯-邻联甲苯胺溶液对于定性

鉴别桑叶生物碱具有专属性。（2）桑叶总生物碱的含量分析。采用雷氏盐比色法测定桑

叶总生物碱的含量，结果显示未能产生沉淀；采用茚三酮比色法测定桑叶总生物碱的含

量，结果表明能够显色，但发现氨基酸会造成较大干扰；因此以上两种方法均不适用。

（3）特征性成分1-DNJ的含量测定。采用柱前衍生HPLC法测定1-DNJ的含量，衍生

试剂为芴甲氧酰氯；结果，线性回归方程为Y=0.55365X–10.13905，R2=0.9997，方法

学验证表明具有良好的精密度、准确度和重复性，可用作后续工艺研究的评价指标。

2.桑叶生物碱的提取纯化研究。（1）提取。采用水煎煮法制备桑叶浸膏并制成冻

干粉。经单因素考察及响应面优化，得到的提取工艺参数为：提取时间44min、提取次

数4次、料液比1:34；此条件下，桑叶浸膏冻干粉的得率为32.53%，经检测1-DNJ的

含量为7.92±0.084mg/g。（2）纯化。采用水提醇沉、氧化铝柱层析、阳离子交换树脂

层析以及正丁醇萃取依次纯化，并制成冻干粉，得到桑叶生物碱纯化物，经分析，纯化

物中1-DNJ的含量为103.99±0.09mg/g，较纯化前提高了9.67倍。

3.桑叶生物碱的体外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶的抑制活性评估。（1）体外抗氧

化活性测定。以抗坏血酸为对照，采用DPPH法、ABTS法以及FRAP法测定桑叶生物

碱特征性成分1-DNJ的体外抗氧化活性。结果，2mg/mL的1-DNJ对DPPH·自由基的

清除率为（23.44±0.49）%、对ABTS·自由基的清除率为（16.49±0.33）%、FRAP法测

得的吸光度值为0.122±0.009，而0.1mg/mL的抗坏血酸的相应抗氧化活性均已达峰值，

因此1-DNJ的体外抗氧化能力很弱。（2）对α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究。筛选出了

桑叶生物碱对α-葡萄糖苷酶的最佳反应的酶量是1.5U/mL，最佳底物浓度为1.75

mmol/mL；以阿卡波糖为阳性对照，测定了桑叶生物碱纯化物、1-DNJ和阿卡波糖对α-

葡萄糖苷酶的抑制率，IC50值分别为67.49、56.23、61.64µg/mL，表明在相同浓度下1-

DNJ的抑制作用强于阳性药物阿卡波糖，而桑叶生物碱纯化物的抑制率与阿卡波糖接近。

4.桑叶生物碱W/O/W双重纳米乳的制备工艺研究。以粒径和PDI为指标，筛选合

适的处方组成与超声制备条件。（1）处方组成筛选。根据单因素实验结果，选择油相为

肉豆蔻酸异丙酯（IPM），亲油性乳化剂为司班80（Span80），亲水性乳化剂为吐温80

（Tween80）；其中Span80含量为8%，内水相与油相的比例为3:7，Tween80含量为

8%，初乳与外水相的比例为2:8。（2）超声制备条件筛选。采用两步法制备W/O/W双

重