病毒学第七章病毒基因.pptVIP

杆状病毒表达体系的优点：杆状病毒表达体系具有与高等真核细胞类似的蛋白修饰，加工和转运体系，其表达的外源基因产物在抗原性、免疫原性和功能上均与天然蛋白相似。构建杆状病毒载体的主要基因为多角体基因ph和p10，为病毒复制非必须基因。多角体基因ph和p10有非常强大的启动子，可使目的基因大量表达，可达细胞总蛋白量的25%。杆状病毒基因组较大（130Kb），适合克隆大片段外原基因，还可以同时表达几个基因。杆状病毒不感染脊椎动物，比较安全。第30页，共54页，星期日，2025年，2月5日第31页，共54页，星期日，2025年，2月5日三、动物病毒载体

1、SV40（猴病毒40）病毒作为载体第32页，共54页，星期日，2025年，2月5日（1）SV40基因组（多瘤病毒科）其基因组为共价闭合环状双链DNA，只有5243个碱基对。是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒。（2）SV40的复制和增殖SV40感染敏感的猿猴细胞后，经过8-12小时的潜伏期，脱去外壳，DNA进入细胞核。首先启动早期转录，在细胞质中翻译产生T和t抗原。当两种抗原积累到足够量时，DNA开始复制，同时启动晚期转录，翻译产生壳蛋白VP1、VP2、VP3，将DNA包装成病毒颗粒。当细胞内病毒颗粒多达105时，细胞破裂，释放出大量病毒颗粒。第33页，共54页，星期日，2025年，2月5日SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumorantigen，T抗原)，其分子量分别为94000(大T抗原)和17000(小T抗原)。T抗原有以下的作用:通过抑制宿主细胞Rb和p53基因，促使细胞分裂；阻止细胞凋亡；结合在SV40的复制起点，起始病毒复制；关闭病毒早期转录；启动病毒晚期转录；在病毒组装中起作用；小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。第34页，共54页，星期日，2025年，2月5日SV40DNA中的非必须区很小，故在向SV40插入外源基因时，须除去某些区段，同时采取相应补救措施。早期基因被置换时，不能合成T抗原，一般采用cos细胞来解决。Cos细胞是已经被SV40DNA转化了的猴传代细胞，其染色体内的SV40DNA可编码T抗原，但没有复制起点，病毒不能复制。将重组DNA导入cos细胞，可形成含有重组DNA的病毒颗粒。（3）构建SV40克隆载体的基本策略和途径第35页，共54页，星期日，2025年，2月5日晚期基因被置换，则不能合成衣壳蛋白，形成缺损性病毒。需要另一个SV40的温度敏感变异株作为辅助病毒，两者同时感染相容性细胞，形成含外源基因的重组病毒颗粒。一般来说，在相容性细胞中，病毒晚期基因启动子的转录水平高于早期启动子。第36页，共54页，星期日，2025年，2月5日（4）SV40作为克隆载体有其局限性：①病毒最终裂解细胞，不利于基因表达；②早期功能区与病毒的致癌性有关，使用时有顾虑；③重组DNA片段的大小受体限制。包装严格，不能包装大于SV40-DNA的分子。第37页，共54页，星期日，2025年，2月5日第二节：病毒基因工程应用举例一、噬菌体展示噬菌体展示技术（phage?display?techniques，PDT）是以改造的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质，并实现基因克隆化的一种重要的分子生物学技术。第38页，共54页，星期日，2025年，2月5日病毒学第七章病毒基因第1页，共54页，星期日，2025年，2月5日本章重点1.几种重要的基因工程载体2.噬菌体展示的原理第2页，共54页，星期日，2025年，2月5日人们研究病毒，一方面是为了控制病毒性疾病，另一方面也是为了利用病毒服务人类。1953年Watson和Crick发现了DNA双螺旋结构，开创了分子生物学的新时代。1970年H.M.Temin和D.Baltimore对RNA肿瘤病毒反转录酶的发现，不仅使DNA复制的中心法则得以完善和发展，同时使RNA反转录为cDNA成为实验室常规手段，也使基因工程这门学科得到了飞速的发展。第3页，共54页，星期日，2025年，2月5日病毒基因工程就是利用重组DNA技术，以病毒为载体，高效表达病毒基因及其它外源基因或者对病毒基因组进行改造，用于