鸡腺胃型传支病毒的分离鉴定.docxVIP

鸡腺胃型传支病毒的分离鉴定 1997年12月，在德阳血液系统和肾脏下部的一个分支出现，声音群的生长受阻。病变的鸡非常瘦，伴随着稀释和哭泣。最后，由于严重的疲劳，病理改变是胰腺胃肿、胰腺胃壁肿胀、腺体胃粘膜乳头出血和出血。该病以20～70日龄的鸡多发,发病率高,某些鸡群发病率高达95%,死亡率3%～95%不等,给养鸡业造成严重的经济损失。为控制该病的发生与流行,笔者对当地发病鸡群进行了病原的分离与鉴定工作,随后进行了灭活油苗的研制,通过试验室和田间试验,证实可控制该病的发生。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 疾病信息来源 采集德州市的病死鸡腺胃组织。 1.1.2 鸡和实验 SPF种蛋购自山东省家禽研究所SPF种鸡场,洁净孵育至10日龄。试验用鸡也由该鸡场提供。 1.1.3 试剂 硬脂酸铝、吐温-80、司班-80均购自天津天大试验化上厂; 10号白油购自杭州炼油厂。 1.2 方法 1.2.1 鸡红细胞回复突变试验f ①病毒的分离。无菌采取病死鸡的腺胃及脾组织,控1:5的比例加入内含1万单位/ml青、链霉素的生理盐水制成匀浆,反复冻融3次,4℃3000r/min离心30min,上清过滤除菌。尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚,0.2ml/胚,37℃孵育。收集36h后死亡胚及部分72～96h活胚尿囊液,余者继续孵育至19日龄,并观察鸡胚发育、死亡及病变情况。连续盲传5代; ②分离病毒的血凝特性。取尿囊液,按文献2方法进行了经1%胰酶处理和未经胰酶处理时鸡红细胞的血凝和血凝抑制试验; ③电镜观察。尿囊液在4℃条件下,10000r/min离心30min,沉淀用磷钨酸染色后,进行病毒粒子形态的电镜观察; ④动物回归试验。尿囊液毒接种10日龄SPF雏鸡10只,每鸡1ml,滴鼻或气管内接种2滴,口服0.2ml,余者肌注。同时设对照鸡5只,隔离同条件饲养。对死亡鸡采病料进行病毒分离和病理学检查。 1.2.2 病毒的传播和繁殖 分离病毒用灭菌生理盐水10倍稀释店,分别以0.2ml/胚的剂量接种10日龄鸡胚,收取36～96h内死亡及存活鸡胚的尿囊液,甲醛灭活。 1.2.3 免疫预防试验 取病死鸡的脾脏、胰脏及腺胃按1:4的比例制成匀浆,冻融3次,3000r/min离心30min,上清用甲醛灭活,安检后,在3个个体养鸡户共5000只鸡分别同时进行免疫预防与对照试验。 1.2.4 田间应用试验 取灭活后的尿囊液与灭活后的新城疫、呼吸型或肾型传支病毒尿囊液按一定的比例混合后加吐温-80制成水相,与用10号白油、司班-80及硬脂酸铝制成油相一起乳化制成三联油乳剂灭活苗,并在安丘、郓城、德州等地的鸡场进行了田间应用试验。 1.2.5 疫苗属性测试 对制备好的油乳剂灭活苗进行了冷水表面试验、稳定性试验、存放试验、粘度和粒子形态及大小测定。 1.2.6 安全试验 分别进行了灭活尿囊液的细菌学检验、SPF鸡胚、雏坞和育成鸡接种试验。 1.2.7 各组大鼠选取或注射油苗 将各适龄易感鸡30只,随机分为2组,其中免疫组20只,对照组10只。免疫组颈部皮下或胸肌注射油苗0.25ml或0.5ml。免疫后20d测定抗体水平,并用分离株尿囊液毒攻击,每只0.5ml或1ml,攻毒后随时观察试验鸡的发病情况。 1.2.8 田间免疫试验 自1998年初以来,采用不同批次的油苗在不同地区对不同品种的鸡进行田间免疫试验,并对德州、安丘、郓城等地的鸡场进行了跟踪调查。 2 结果 2.1 传代次数对胚体的影响 分离病毒在盲传中,不经胰酶处理,均无HA活性。随传代次数的增加,死胚逐渐减少,但胚体卷缩越发明显,至5～6代时出现明显的侏儒胚,胚体约为对照胚的1/2,且胚体充血、出血明显。 2.2 凝集结果及血清细胞系统对bv的影响 分离毒未经胰酶处理时对鸡红细胞无凝集作用,而经1%胰酶37℃处理3h后,对1%的鸡血细胞悬液有28～9的凝集价,同时,该凝集现象不能被IBVM41株、 T株、 H52,肾型IBV及NBV等相应的阳性血清所抑制。 2.3 电镜观察 可见到不同数量的略呈球状的完整病毒粒子,表面有囊膜,囊膜表面有顶部膨大的突起,呈冠状排列,整个粒子直径为80～140nm。 2.4 剖检变化血点变化 接种4d后,试验组部分鸡开始拉稀,同时伴有流泪、肿眼或咳嗽、呼吸罗音等呼吸道症状,病鸡精神萎顿,食欲减退,鸡体消瘦,剖检可见腺胃肿大如球状、坚实,腺胃壁增厚,腺胃粘膜有出血点,部分出现溃疡,也有的鸡腺胃乳头凹陷不清,并有出血,1只鸡肾脏肿大,有白斑。腺胃组织按前述方法处理后SPF鸡胚接种可见2.1的结果,电镜观察可见2.3结果。 2.5 疫苗分层现象测定 将油苗滴于冷水表面,呈不向四周扩散的规则圆形,证明该油苗剂型是油包水型。稳定性试验,以3000r/min离心30min,疫苗不出现分层