病理学病理学常用技术.docxVIP

病理学常用技术 病理学研究和学习的最基本技术是肉眼的大体观察和光学显微镜水平的形态学观察。随着现代生物医学技术的快速发展，各种高新病理学研究方法与技术的使用，进一步深化了对疾病发生机制和发展规律的认识，拓宽了医学工作者的视野，提高了医学研究水平和对疾病诊断的准确性。以下介绍病理学常用的一些技术。 一、大体观察和组织细胞学技术 1.大体观察 又称肉眼观察。主要运用肉眼或辅以放大镜、量尺等辅助工具，对检查材料及其病变性状（大小、形态、色泽、重量、质地、表面及切面状态、病灶特性、与周围组织和器官的关系等）进行细致解剖、观测、取材和记录。肉眼观察可以初步确定病变的部位、范围、形态、颜色等重要特征，是病理学主要的观察手段之一。 2.组织细胞学观察 又称光镜观察。将病变组织取材后制成切片，或将采集的病变处细胞制成涂片，用不同方法染色后，在光学显微镜下从组织或细胞水平观察分析其形态结构的特点，做出疾病的病理诊断。组织切片最常用的制片技术是石蜡切片，最常用的染色方法是苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，所制组织切片可长期保存，是疾病诊断和研究的最常用方法。冰冻切片属于快速制片技术，是借助低温使组织达到一定的硬度后再进行切片的一种方法。由于不需经过固定包埋和切片后处理等实验步骤，并且能很好地保存组织抗原和酶的活性，可以与HE染色、免疫组化、原位杂交技术等相结合，因此冰冻切片更大范围地用于临床手术中的快速病理诊断和病理学科研工作中。 3.组织和细胞培养 是将离体活组织或细胞用适宜的培养基在体外培养，使其生长增殖，并维持其结构和功能的一种方法。通过体外培养可以获得单一种类的细胞，简便而直观地观测组织细胞生长过程中的形态和生物学特性，施行定性或定量分析，并可以研究各种因素对组织细胞的影响。该方法既可以模拟病理过程，也可以进行体外治疗试验。组织和细胞培养研究的优点是体外因素容易控制，试验周期短、相对经济而简便。根据研究目的，用于培养的组织细胞可为正常或病变部位的人体组织细胞，也可为动物模型的样本，还可为原代细胞培养或经加工、修饰的组织和细胞。 二、免疫组织化学技术 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）技术简称免疫组化，是利用抗原与抗体特异性结合的原理，检测和定位细胞或组织中某种物质的技术，由免疫学和传统的组织化学相结合而形成。通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组化有较高的敏感性和特异性，能将形态学改变与功能、代谢变化相结合，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上观测蛋白质或多肽类物质的定性与定位。 1.免疫组化染色方法和检测系统 根据标记物性质可分为荧光法（荧光素标记）、酶法（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、免疫金银及铁标记技术、免疫电子显微镜技术等；按染色步骤可分为间接法（二步、三步或多步法）和双标记或多重标记法；按结合方式可分抗原抗体结合，如PAP法和标记的葡聚糖聚合物法（附图1），以及亲和连接，如ABC法、标记的链亲和素-生物素法等，其中葡聚糖聚合物法和标记的链亲和素-生物素法是最常使用的染色方法，阳性信号呈棕色细颗粒状。 附图1　免疫组化原理模式图（葡聚糖聚合法） 2.免疫组化的染色结果 免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。抗原的表达与被检查抗原在细胞内的定位有关，常见抗原的表达阳性定位有以下几种：①细胞质阳性反应；②细胞膜阳性反应；③细胞核阳性反应（附图2）。由于抗原分布本身特性或制样的影响，有时可见细胞质和细胞膜同时出现阳性反应。 附图2　免疫组织化学染色阳性信号定位 A.细胞质内弥漫性阳性（Vimentin）；B.细胞膜阳性（E-cadherin）；C.细胞核阳性（Snail） 3.免疫组化技术的应用 随着大量商品化的单克隆或多克隆抗体出现，配套试剂盒的使用及实验方法的不断完善，免疫组化技术已成为临床病理诊断和医学基础研究中广泛应用的病理学技术之一。免疫组化可以用于各种蛋白质或者肽类物质表达水平的检测、细胞类型判定、细胞增殖与凋亡研究、激素受体和耐药基因蛋白表达的检测等。特别是应用免疫组化技术，对一些组织特异性抗原的检测有助于进行肿瘤细胞来源与分化表型的判断、肿瘤分期的确定、肿瘤预后的评估、临床对肿瘤靶向治疗药物适用的筛选等。目前，精准医疗强调与患者分子生物病理学特征相匹配杂交技术、激光扫描共聚焦显微术、生物芯片技术等相结合，可以在很大程度上帮助解决肿瘤精准医疗的诊断与治疗所面临的问题。 三、电子显微镜技术 电子显微镜技术（electron microscope，EM）简称电镜，是利用电子束和电子透镜观察经特殊制备样本的微细结构与形态的技术。目前最好的