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病毒受体的研究进展 病毒受体的研究一直是病毒研究的热点。病毒受体是病毒入侵靶细胞的门户,能特异性的与病毒结合,介导病毒入侵,是关系到病毒宿主范围的一个决定性因素。随着研究手段的进步,近年来有关病毒受体的研究已有较大进展,部分病毒受体的结构和功能已在不同程度上得到确认。绝大多数受体的本质是蛋白,所以研究蛋白相互作用的方法都可用来研究受体。鉴定受体的研究方法总体上从蛋白和基因两个途径入手。较早用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法是偶联、免疫共沉淀等生物化学方法及病毒蛋白铺覆技术(Virus overlay protein blot assay,VOPBA)等。近年来开始采用一些以DNA重组克隆为基础的分子生物学方法,如噬菌体展示、酵母双杂交系统等。每一种方法各有所长,有时需要联合应用,相互印证结果的可靠性。 WSSV(对虾白斑综合症病毒)是近年来对虾暴发性流行病的主要病原,如果我们掌握了其受体的结构、功能,就可以更好的了解病毒的传染机制、致病机理。预防与治疗的思路之一,就是从切断传播途径入手,合成类似受体的、可与病毒结合的阻断剂、抗体等新型药物,来控制病害的蔓延与传播;另外就是根据其受体基因结合遗传育种技术筛选、培育抗病个体。目前相关WSSV受体的研究报道还较少,本文旨在通过对可用于病毒受体鉴定的方法进行介绍和总结,为对虾病毒受体的筛选鉴定提供参考。 1 病毒与受体的结合 病毒铺覆蛋白印迹技术是较早用与病毒受体鉴定的方法。它是在Western印迹技术的基础上,利用病毒与受体特异性结合的特点,对病毒受体进行鉴定的方法。它的基本操作步骤是,利用清洁剂裂解细胞膜然后做SDS电泳,转印于硝酸纤维素膜,与病毒结合,最后洗去未结合病毒。病毒与受体结合的显示方法有两种:一是直接利用同位素标记的病毒粒子;二是用单克隆抗体或多抗与病毒结合。使用多抗要避免与寄主蛋白发生交叉反应,如有交叉反应,可通过寄主蛋白预吸收封闭与多抗结合的寄主蛋白来消除。使用本方法的前提是受体活性是由单一多肽决定而不需要膜的其它组份,而且经过裂解液的处理不会丧失活性。如是碳水化合物型受体,就可用薄层层析来分离糖脂,然后检测与病毒的结合情况。用此方法进行受体研究的病毒有:登革热病毒、斜纹夜蛾多角体包埋型病毒、牛病毒性腹泻病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、麻疹病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病毒、猪流行性腹泻等。 2 噬菌体的分子检测 噬菌体展示的基本原理就是将外源基因插入到噬菌体衣壳蛋白基因中使之与衣壳蛋白融合表达,随着噬菌体的成熟装配,融合蛋白展示于噬菌体表面并能保持较好的空间构型。到目前为止,利用此方法已陆续建立了噬菌体随机肽库、抗体库、cDNA展示文库等技术,并广泛用于配体-受体关系的研究中。 以丝状噬菌体为例,丝状噬菌体属于单链DNA病毒,其DNA在细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒(每代约100个)。较早发展的是f1,fd和M系列丝状噬菌体载体,它们的单链DNA长约7 000bp,一级结构极为相似(99%同源性)。其编码的主要衣壳蛋白为pⅧ,其次为pⅢ,pⅥ,pⅦ和pⅣ。展示区利用的是pⅢ和pⅧ的N端,因为此端是游离的。要表达的序列插入其末端以融合蛋白的形式表达。利用噬菌体筛选目的蛋白基于3个基本事实①插入外源基因并表达在噬菌体颗粒表面,不影响噬菌体的生活周期,同时其外源蛋白天然构象也能被相应的抗体或受体所识别②利用连接于固相支持物(玻璃珠、酶标板等)的靶分子(或统称筛选剂或受体),可以采用适当的Panning方法(亲和、洗脱、扩增、亲和的循环步骤)洗去非特异结合的噬菌体,最终筛选出能结合靶分子的目的噬菌体(或统称配体)③外源蛋白或多肽表达在噬菌体表面,其编码基因与噬菌体DNA是偶联的,通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出来,这是其它一些技术做不到的 ,此技术的优势是可在体外完成对外源多肽或蛋白的研究并方便的获得目的DNA序列。这类单链噬菌体是测序和突变分析的理想材料,不足是培养期长、不稳定、表达的肽链较短。 近年来发展的λ噬菌体、T7噬菌体等裂解性噬菌体载体生长快,稳定性强,可表达较长序列,并且其构象更接近于天然情况,适合用来构建cDNA展示文库,董倩等利用T7cDNA噬菌体展示方法筛选了乙型肝炎病毒前S1蛋白的结合蛋白。 由于原核表达系统没有对真核基因内含子的剪接功能,所以噬菌体展示系统只能表达原核生物基因、不需要内含子及外显子拼接的DNA病毒,或是由真核生物或RNA病毒等的mRNA反转录的cDNA。 3 酵母双杂交系统论yeastwell 随着分子生物学技术的发展,近年来开发了一些研究蛋白之间相互作用的更简便有效的方法。其中之一是由Fields和Song创立的酵母双杂交系统(Yeast Two-Hybrid Systems),与