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蛋白质间相互作用研究分析技术的研究进展 蛋白质组是后基因组时代出现的一个新领域。这是对身体、组织或细胞所有蛋白质的形态和功能模式的研究。2003年4月人类基因组图谱基本绘制完成,生命科学的重心开始转移到对基因的表达产物——蛋白质的研究。生物体内大多数生命活动是通过各种蛋白质的参与而完成的。在细胞内,蛋白质间相互作用体现在酶与其蛋白底物的作用以及短暂或持久的蛋白装配(此装配在控制信号转导、细胞分裂、DNA复制和转录起始等方面发挥作用)上;在细胞外,蛋白质间相互作用促使了细胞间相互交流,表达在细胞表面的配体可与表达在邻近细胞的蛋白受体结合,而细胞分泌的蛋白配体则可以与远处细胞的受体结合。了解蛋白质间相互作用的方式、程度及结果,将有助于蛋白质功能的分析、生命发育的探索、疑难病理的研究及药物的开发等。因此,揭示蛋白质间相互作用关系,建立其相互作用关系网络图,已成为蛋白质组学研究的热点。本文对用于蛋白质间相互作用研究的各种新型分析技术作一综述。 1 基于蛋白间相互作用的诱导表达质粒的构建 酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)由Fields和Song(Nature,1989年)首创,是建立在对真核转录激活因子认识的基础上。真核转录激活因子包括两个功能结构域:一个是与DNA上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合的DNA结合结构域(DNA-binding domain,BD);另一个是DNA激活结构域(DNA activation domain,AD)(见图1)。当某一报告基因位于UAS下游时,转录因子中的AD区可通过BD区与UAS结合而激活报告基因的转录。这两个结构域在功能上是可以分离的,当将它们彼此分开时,BD仍可结合DNA,但因缺少AD而不能激活转录;而AD虽可激活转录,但却无法正确地定位到特异的DNA序列上。只有当通过某种相互作用将它们联系在一起时,它们才具有转录因子的功能,激活下游报告基因的转录。在目前通用的酵母双杂交系统中,根据BD来源不同可分为GAL4系统和LexA系统,其中GAL4系统用于真核细胞中,而LexA系统用于原核细胞中,其转录启动因子是LexA。 利用此原理,可构建两个重组质粒,将目的蛋白的基因转入带有BD结构域的质粒载体中,并把其转入酵母细胞中表达一个融合蛋白——诱饵蛋白(bait);把要筛选的cDNA文库中所有基因片段克隆至带有AD结构域的另一质粒载体中,表达另一个杂交蛋白——靶蛋白(prey)。然后共转化酵母菌或是通过两个单倍体酵母菌融合,在选择性缺陷培养基上筛选,通过对报告基因表型的鉴定来确定两个蛋白是否存在相互作用。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因,从而有利于转化后质粒的筛选和鉴定。转化的酵母菌株应该带有一个或多个报告基因,常用的报告基因有HIS3、LACZ、ADE2和URA3等,转化的菌株则具有相应的缺陷型。依靠简便的酵母遗传分析以及对报告基因表型的检测,就可以进行蛋白质间相互作用的研究。Sullivan等通过酵母双杂交系统对果蝇飞行肌肉中涉及糖分解途径的6种糖分解酶进行蛋白相互作用分析,成功鉴定出两组相互作用的蛋白,分别是GPDH 和 GAPDH与GPDH 和 PGLYM。Song等利用LexA和B42系统,通过酵母双杂交方法发现,Prox1蛋白与胆汁合成基因CYP7A1的转录激活子HNF4可发生强烈特异性的相互作用,从而抑制CYP7A1基因的表达。Rebecca等通过酵母双杂交系统将全长的轮状病毒肠毒素NSP4及其7种突变体作为诱饵,胞膜窖结构蛋白Caveolin-1作为靶标,测定出NSP4的112~140残基可直接作用于Caveolin-1蛋白。 随着功能基因组学和蛋白质组学研究的开展,需要分析各种物种、组织或细胞中所有蛋白之间的相互关系,以构建蛋白质相互作用图谱。为适应这种需要,大规模双杂交筛选技术应运而生。目前,大规模酵母双杂交技术已成功应用于牛痘病毒、肝炎病毒C、番茄病毒A、噬菌体T7等多种蛋白体系的研究,其中基因开放阅读框(open reading frame,ORF)表达克隆集合的获得为蛋白质相互作用图谱的构建提供了条件。ORF组学通过原核或真核系统中ORF的表达,对所有功能蛋白进行分析,并应用酵母双杂交系统,将诱饵蛋白和靶蛋白系统进行两两配对表达,为蛋白质相互作用研究提供蛋白组学规模的数据,从而用于构建相互作用组图谱。 酵母双杂交系统采用体内实验,不易受外界环境的影响,不需要蛋白质的大量纯化,就可以检测到蛋白间微弱的相互作用。但该系统也存在一定的局限性:1)不能检测3个以上蛋白的相互作用以及相互作用蛋白质的动力学;2)易产生假阳性结果。某些蛋白由于本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作用