SN_T 3065-2011水稻细菌性谷枯病菌检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3065—2011水稻细菌性谷枯病菌检测方法Methods for detection of Burkholderia glumae2011-09-09 发布2012-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防任 SN/T 3065—2011言前本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：莫瑾、彭梓、钟文英、朱金国、赵文军、朱水芳、姜金林、唐连飞。 SN/T 3065—2011水稻细菌性谷枯病菌检测方法1 范围本标准规定了水稻种子和水稻植株中的水稻细菌性谷枯病菌检测方法。本标准适用于水稻种子和水稻植株中的水稻细菌性谷枯病菌的检测。12规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB15569--2009农业植物调运检疫规程ISTA国际种子检验规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1gyrB 基因gyrB gene编码能诱导 DNA 负超螺旋拓扑异构酶一DNA 促旋酶的 B亚单位蛋白 GyrB的基因片段。3.2聚合酶链式反应polymerase chain reaction; PCR模板 DNA先经高温变性为单链，在 DNA 聚合酶和适宜的温度下，两条引物分别与模板 DNA两条链上的-一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP为底物，使退火引物得以延伸,如此反复变性、退火和 DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的 DNA片段呈几何倍数扩增。3.3实时荧光 PCR real-time fluorescence PCRPCR反应体系中加人一个特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时，Taq酶的5→3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR产物形成完全同步。3. 4Ct 值 Ct value每个实时荧光PCR反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。.4设备和材料4.1 离心机:转速≤15000g。 SN/T 3065--20114.2PCR扩增仪。4.3实时荧光定量PCR仪。4.4恒温培养箱。4.5天平：精度0.1g。4.6高压灭菌器。4.7 冰箱。4.8均质器：转速4000g～8000g。4.9生物安全柜。4.10 可调移液器:0.5μL～10 μL,10 μL～100 μL,100 μL～1 000 μL。4.11灭菌平Ⅲ。*Y5培养基5.1 S-PG培养基:见 A.1。5.2 CCNT 培养基:见 A.2。5.3 SPA 培养基:见 A.3。5.40.001%吐温20-磷酸盐缓冲液6抽样水稻种子抽样可参照ISTA《国际种子检验规程》或孝~QB-15569一2009中6.2方法进行。7样品处理及分离7.1水稻种子大量种子样品先用蒸馏水冲洗后，称取10g或400粒种子放人90mL.0.001%吐温-磷酸盐缓冲液(pH7.0)中低温(5℃～15℃)浸泡4 h～6h,用离质器打碎，制备样品提取液。若检测少量的种子样品，取20粒种子加人10mL灭菌的0.b01%吐温磷酸盐缓冲液dpH7.0）用灭菌和研钵或是均质器将种子充分碾磨，制成提取液。将样品提取液置于22℃～25℃环境中4 h～h后，旋涡混句感浮液5min，悬浮液进行十倍梯度稀释,稀释后的10×、100X和1000×三个稀释度的悬浮液各取 0.3mL,分别移人 3个 S-PG 和 CCNT的平Ⅲ中（每个平血加0.1mL）。用 L-型玻璃棒将液体均匀涂布在琼脂的表面。7.2水稻组织材料7.2.1 无症状的组织可将10g左右样品直接放人90mL0.001%吐温-磷酸盐缓冲液中，均质1min制备成样品提取液。按7.1方法进行分离培养。7. 2. 2 未显症状的可疑组织用灭菌的剪刀剪成2 mm×7mm 大小的小块，放人 S-PG 和 CCNT 平板中，滴人 2滴～3滴（约0.2 mL)的生理盐水,放置 5min～10 min,让细菌从这些组织中渗出。2 SN/T 3065--20117. 2. 3 有明显症状的叶片从叶片损伤部位的前端切下2mm×7mm片段。于70%的乙醇中浸泡15s～30s，消毒叶片组织。再用灭菌蒸馏水清洗叶片2次～3次后放入 S-PG和 CCNT平板上。如果