SN_T 1146.2-2017烟草环斑病毒分子生物学检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1146.2—2017代替 SN/T 1146.2--2009烟草环斑病毒分子生物学检测方法Molecular detection of Tobacco ringspot virus2017-07~21 发布2018-03-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真优 ： SN/T 1146.2—2017前 言SN/T1146共分为3部分：-第1部分：植物检疫‧烟草环斑病毒检疫鉴定方法；-第2部分：烟草环斑病毒分子生物学检测方法；第3部分：烟草环斑病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1146的第2部分。本部分按照GB/T1.1----2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1146.2—2009《烟草环斑病毒分子生物学检测方法》。本部分与SN/T1146.2一2009相比，主要技术差异如下：附录C核酸抽提中增加了磁珠吸附法和商品化试剂盒法；-PCR引物有所调整；-增加了RT-LAMP检测方法；-增加了缓冲液的配制方法；-删除了附录 A 烟草环斑病毒基本信息。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人：杨翠云、于翠、张露茜、胡培龙、焦彬彬、邓丛良、魏梅生、高辉、乔艳艳。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T 1146.2---2009。 SN/T 1146.2—2017烟草环斑病毒分子生物学检测方法1范围SN/T 1146 的本部分规定了烟草环斑病毒分子生物学检测的基本原则和方法。本部分适用于无性繁殖材料、组培苗、鳞球茎和种子苗木中携带的烟草环斑病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T 1146烟草环斑病毒检疫鉴定方法3*烟草环斑病毒基本信息中文名：烟草环斑病毒英文名:Tobacco ringspot virus缩写：TRSV分类地位：豇豆花叶病毒科（Comoviridae），线虫传多面体病毒属（Nepovirus）。传播途径：该病毒可以通过种子、嫁接、机械接种和介体进行传播。传毒介体主要是美洲剑线虫（Xiphinema americanum）；大豆、甜瓜、莴苣、豇豆、千日红、马铃薯和天竺葵等都可种传，大豆种传率高达 40%～100%。基因组：病毒基因组含两条 ssRNA。RNA-1 长 7.514 kb，RNA-2 长 3.929 kb，外壳蛋白基因1.548 kb.4方法原理烟草环斑病毒的血清学和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据。采用RT-PCR、IC-RT-PCR、实时荧光RT-PCR 和 RT-LAMP等分子生物学方法进行该病毒的检测。5仪器设备、用具和试剂5.1仪器设备PCR仪、实时荧光定量 PCR仪、超净工作台、电子天平（1/10 000 g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、水浴锅、高速冷冻离心机、冰箱、80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器、pH计等。5.2用具可调式微量移液器(2 μL、10 μL、100 μL、200 μl、1000 μl、5000 μL)及相应的无RNA 酶吸头、无1 SN/T 1146.2-2017RNA酶离心管、PCR管、磁性分离架和研钵等。5.3主要试剂除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯。试验用水应符合GB/T6682中相关规定。烟草环斑病毒抗体、植物总RNA提取试剂盒、纳米磁珠、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇、AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、DNA分子标记物、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。各种缓冲液的配制方法见附录A。6 病毒检测6.1抽样和制样按照SN/T1146规定的方法执行。6.2检测方法实验室可以根据仪器的配备情况，采用RT-PCR（见附录 B）、IC-RT-PCR（见附录 C）、实时荧光RT-PCR(见附录D)和 RT-LAMP(见附录E)进行烟草环斑病毒的检测。7结果判定样品经RT-PCR、IC-RT-PCR、实时荧光RT-PCR和RT-LAMP几种方法之一检测为阴性时，应判定样品不携带烟草环斑病毒。样品经,RT-PCR 和IC-RT-PCR检测为阳性，需要进行序列测定，如果序列测定结果证实与所检测的烟草环斑病毒一致，应判定样品携带烟草环斑病毒。样品经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，应判定样品携带烟草环斑病毒。样品经RT-LAMP检测为阳性时，需要再经 RT-