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酶联免疫吸附实验 ELISA －－操作规则（新手适用） 一、实验目的 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称 ELISA)是在 免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫 测定技术 ELISA 过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗 体(抗原)，再加相应酶标记抗体(抗原)，生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标 记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸 收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 二、实验原理 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶 β －Ｄ－半乳 糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶 6 －磷酸葡萄糖脱氧酶等。常 用于 ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化 物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中 的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。 辣根过氧化物酶 （HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素 (protonhemin)区作辅基。酶的 度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅 基的最大吸收峰是 403nm HRP 酶蛋白的最大吸收峰是 275nm，所以酶的 度 和纯度计算式是（已知 HRP 的 A(1cm 403nm 1%) ＝25，式中 1％指 HRP 百分 度为 100ml 含酶蛋白 1g，即 10mg/ml，所以 酶 度以 mg/ml 计算是 HRP 的 A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP 纯度 (RZ)=A403nm/A275nm 纯度 RZ （Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度 HRP 的 RZ 值在 3.0 左右，最高可 1 达 3.4。用于 ELISA 检测的 HRP 的 RZ 值要求在 3.0 以上。 （二）酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是 ELISA 成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应 还具有酶促反 应 显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。 免疫技术常用的酶及其底物 测 定 波 酶 底物 显色反应 长 邻苯二胺 橘红色 492* 四甲替联苯胺 黄色 460** 氨基水杨酸 棕色 449 辣根过氧化物酶 邻联苯甲胺 兰色 425 2 2-连胺基-2(3- 乙基 蓝绿色 642 -并噻唑啉磺酸-6)铵盐 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 黄色 400 碱性磷酸酯酶 萘酚-AS-Mx 磷酸盐+